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RAPD、SRAP和ISSR标记在香菇种质资源的应用及其SCAR标记的建立

应正河  
【摘要】:DNA分子标记由于检测手段简单、高效,渗透到许多领域,在遗传育种研究、检测和基因克隆、研究种间的遗传多样性和确定遗传关系都有广泛应用。 在研究中,我们应用RAPD、ISSR和SRAP标记对40个香菇栽培种进行种质资源研究。在揭示香菇遗传多态性方面,这些标记已被证明是一种快速、可靠的检测工具。和RAPD、SRAP和ISSR标记比较,SCAR标记更稳定,重复性好。由RAPD标记转化而来的SCAR标记研究很多,但是由ISSR标记转化而来的SCAR标记研究很少,关于由SRAP标记转化SCAR标记的研究还没有见报道,本实验第一次研究了SRAP标记转化SCAR标记。一些标记被成功转化成了SCAR标记,这可以为我国实行香菇品种登记制度和知识产权保护提供信息。 首先对香菇RAPD、SRAP和ISSR的反应体系进行优化,尤其是对反应体系影响较大的因素如温度、Taq酶用量、dNTP浓度、Mg~(2+)浓度、引物浓度和模板浓度进行优化。通过单因素实验,建立了每个标记的最佳反应体系。在RAPD、SRAP和ISSR标记中,它们平均多态性比率分别为55.8%、51.2%、64.8%。通过对ISSR引物的筛选,我们发现香菇基因组中含有较多的三核苷酸重复序列。 采用这三个分子标记分别对40个香菇栽培种进行聚类分析,建立聚类图。通过对它们间的稳定性和重复性的比较,ISSR标记的稳定性和重复性最好,RAPD标记最差。综合这三个分子标记的分析,我们更容易地区分40个多态性较低的香菇栽培种。其中,30(Cr66)与34(L66)、22(申香4号)与31(Cr33)、39(武香)与40(苏香)判断为同种异名。 从这些分子标记扩增产物的图谱中,通过胶回收,我们选取了22个明亮、重复性好的条带进行T-载体克隆和测序。设计了22对引物,在SCAR引物验证中,有14对引物表现出和原标记相似的多态性谱带。这些转化成功的14个SCAR引物中,从6个RAPD标记中成功转化了4个SCAR标记,从11个SRAP标记中成功转化了8个SCAR标记,从5个ISSR标记中成功转化了2个SCAR标记。


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