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龙眼果皮过氧化物酶的分离纯化及cDNA的克隆

林琳  
【摘要】:POD是影响果实褐变的一种重要的酶,目前对POD的研究还只是停留在常规生理、生化的研究上,对相关的分子生物学研究鲜见报道本试验以龙眼果皮为材料,对其中的POD进行了分离纯化、质谱分析和cDNA克隆的研究。 经过40%饱和度硫酸铵盐析、Streamline Phenyl柱、DE-52柱、Phenyl Sepharose High Performance柱、Superdex 200 prep grade柱层析,从龙眼果皮中分离得到了电泳纯的POD。SDS-PAGE结果显示,分离得到的POD亚基表观分子量约为48KD左右;精确分子量测定显示,其分子量为45.65KD;分子筛分子量测定结果显示整蛋白分子约为45KD左右,表明分离得到的POD为单体蛋白,这与之前的研究结果有很大的不同。双向电泳的结果显示了2个分子量相同而等电点不同的蛋白A和B,说明分离得到的POD实际上是2个分子量相同的混合酸性蛋白,由于这2个蛋白的分子量和理化性质十分接近而未能相互分离。 对分离得到的POD中的一个组分POD A,应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行肽指纹图谱分析,未发现能与之匹配的数据。应用电喷雾解离-四极杆-飞行时间串联质谱技术(ESI-Q-TOF2)解析了POD A的2个胰酶水解肽段的氨基酸序列,分别是:WFLSGGDWYSLF和VRESAWLD NDADLLAVP,数据库检索和比对结果显示获得的序列为氨基酸的新序列。多重序列比对结果表明其中含有一些保守的氨基酸序列。 采用同源克隆的方法,获得了龙眼果皮POD的保守区片段,并在此基础上,通过3'RACE和5'RACE,获得了龙眼果皮POD全长cDNA序列。该序列与其他植物的POD cDNA有很高的同源性。该cDNA全长1290bp,其中,5'UTR为52bp,3'UTR为238 bp,在3'UTR区域还含有典型的加尾信号AATAA和poly(A)尾。包含一个996bp的开放阅读框,编码332个氨基酸,在推导的氨基酸序列中发现了活性位点、底物结合区、血红素结合位点和钙结合位点的结构域。将串联质谱测序获得的2个肽段序列与其它植物的POD的氨基酸序列比对的结果显示:获得的肽段序列中有部分氨基酸可与开放阅读框有部分匹配,且这些匹配部分是比较保守的,分别为:E------AD-LA和SGGD----F;同时也发现m/z为1107.49的肽段在的位置在m/z为823.41的肽段的上游,这为克隆分离纯化得到的POD提供了可能。 尝试了龙眼果皮POD cDNA的原核表达。当诱导温度为40℃,IPTG浓度为1mM,


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