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《福建农林大学》 2007年
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柚单染色体微分离及其AFLP分子标记构建

乔锋  
【摘要】: 本研究对琯溪蜜柚单染色体进行大量分离,然后使用LA-PCR、AFLP技术对其进行染色体分子生物学鉴定、分类,为建立直接的、操作性强的分子标记体系打下基础。主要结果和结论如下: 1单染色体显微分离 本实验采用琯溪蜜柚100 d幼果作为材料,进行单染色体微分离。在制片过程中发现,不同的酶解时间对解离的效果差异较大,用2%纤维素酶与0.5%果胶酶的混合液处理40 min~1 h均可以得到比较好的效果,背景比较干净,各染色体充分分散。在后低渗处理之后进行20-30 min冰水处理,制片效果好。以制备的微细玻璃针为微分离工具,利用粘取法在水相中对琯溪蜜柚染色体进行了大量的随机分离,得到32条单染色体。 2基因组DNA提取及单染色体的体外扩增 1)运用改进的方法,提取的DNA质量较好,纯度较高,无RNA和蛋白质的污染。经Sau3A I酶切,其产物为0.3~2 kb范围内均匀的连续带。 2)对微分离得到的32条单染色体进行二轮LA-PCR扩增,结果显示:不同单染色体扩增产物所表现的DNA带分布不相同,有分布范围约在0.6~2 kb连续的DNA带,也有分布范围比较窄。 3单染色体AFLP体系的建立与分析 本实验共筛选20对引物组合,有9对引物组合PCR结果较好,其中5对引物组合A/D、H/L、X/S、C/G和B/N效果明显,PCR产物条带清晰可辩,在多次重复的情况下,实验结果稳定不变。因此,最终以这5对引物组合对32条单染色体进行AFLP扩增。 通过改组AFLP扩增程序,发现Touchdown PCR程序部分采用连续进行四次Touchdown PCR,然后再进行低退火温度PCR,扩增结果最佳。 分别使用筛选后的5对引物组合对32条单染色体进行扩增,所表现的结果呈现出明显不同的多态性;对第一小组中的8条单染色体还使用7个单引物进行扩增。 通过综合分析,最后将32条单染色体归为21类,而不是9类。推测的原因可能是:1)在微分离过程中,单染色体难免会丢失部分的区段。一些相同条带没有扩增出来,因此不可能将他们分为同一类;2)微分离单染色体存在染色体结构变异现象,经过扩增之后产生不同条带,增加了染色体鉴定、分类难度;3)分子生物学基本实验操作过程中的局限性导致分类出现误差。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S666.3

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