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《福建农林大学》 2007年
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番鸭源禽1型副粘病毒P基因克隆及原核表达

林永利  
【摘要】: 禽1型副粘病毒(Avian paramyxovirus type 1,APMV-1)是副粘病毒科副粘病毒亚科禽腮腺炎病毒属的成员,是危害养禽业最为严重的传染病病原之一,其代表毒株为新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)。其引起的疫病——新城疫被世界动物卫生组织(OIE)列为A类烈性传染病,因此其病原的研究也成为禽病研究的重点和热点。 2002年以来,我国浙江、福建等省份部分地区8~40日龄的番鸭发生一种以表现神经症状、呼吸困难、腹泻为主要临床特征的疫病,发病率高达52%,病死率高达30%,经病毒分离鉴定和人工感染试验确定为APMV-1感染。 本实验根据GenBank中水禽源禽1型副粘病毒(ZJ1)P基因序列设计2对引物,运用RT-PCR技术从福建分离的1株番鸭源APMV-1(FP1/02株)的基因组中扩增出P全基因的cDNA。测序结果表明,P基因全长144lnt,包含一个完整的开放阅读框架,编码395个氨基酸,通过Genebank的Blast比对分析,有40多株病毒P基因序列同源性较高(同源性在80%以上),其中与PX2/03株、ZJ1株和SF02株的同源性最高,达97%。同时借助生物学软件及相关在线分析工具对测序完成的P基因进行基于氨基酸序列的生物信息学分析,包括蛋白质理化特性、蛋白质功能域、基序、空间结构等,分析表明P蛋白无信号肽、卷曲螺旋等功能区特征。 以测序正确的P基因为模板,用分别含EcoRⅠ、XhoⅠ的一对引物对该目的基因进行亚克隆后插入到pGEX-5X-1原核表达载体中。重组质粒经酶切鉴定和核苷酸序列分析,结果表明所插入的阅读框正确,序列无误,从而成功地构建了pGEX-5X-1/P原核表达载体。 将测序正确的重组质粒pGEX-5X-1/P分别转化E.coli BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明pGEX-5X-1/P在E.coli BL21(DE3)获得了高效表达,在相应位置上(68KD处)可见明显的目的蛋白表达带;重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达;GST亲和层析纯化收集蛋白,纯化后的蛋白经Western-blot和ELISA初步鉴定能与鸭源禽1型副粘病毒P蛋白阳性血清发生特异反应。 本试验成功地克隆了FP1/02株番鸭源APMV-1 P基因完整片段,并实现了其在原核表达系统中的高效表达。本试验结果为研究番鸭源APMV-1 P基因编码的各蛋白对不同宿主的免疫原性及在APMV-1跨种间致病等方面的作用和禽1型副粘病毒基因工程疫苗、新型诊断试剂的研制奠定基础。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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【同被引文献】
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