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《福建农林大学》 2007年
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毛头鬼伞(Coprinus comatus)多糖的分离纯化及其抗烟草花叶病毒(TMV)作用机制

吴艳兵  
【摘要】: 毛头鬼伞(Coprinus comatus),是一种名贵的食用和药用真菌。经常食用有助消化、增加食欲和治疗痔疮的作用。其子实体和菌丝体均含有活性多糖。现在的研究结果证实它具有降血糖、降血脂、提高免疫活性和抗肿瘤等生物学功能。由于目前对毛头鬼伞多糖的研究侧重于粗多糖,对毛头鬼伞多糖组分的化学性质和结构的研究也很少见报道。 本文主要以毛头鬼伞子实体为实验材料,经对菌株CC969液体深层发酵主要培养基成分的筛选,对毛头鬼伞子实体多糖的分离纯化、理化性质分析、多糖均一组分结构的初步鉴定,以及对毛头鬼伞多糖的抗TMV活性的检测和作用机制的分析,可以得出以下结果: (1)本实验运用单因素和正交试验筛选出毛头鬼伞(Coprinus comatus)菌株CC969的最适发酵培养基组分为:蔗糖2%、玉米粉3%、麦麸4%、酵母粉0.5%、KH_2PO_4 0.25%、MgSO_4·7H_20 0.10%。 (2)毛头鬼伞子实体经沸水浸提、乙醇沉淀可得到毛头鬼伞粗多糖CCP,CCP经Sevag法脱蛋白、脱色后得到多糖CCP1,CCP1经乙醇分级沉淀、DEAESephadex A-25离子交换柱层析、Sepharose6B凝胶柱层析可以得到两种均一多糖CCP60a和CCP60b。毛头鬼伞子实体多糖CCP1、CCP60、CCP60a和CCP60b的中性糖含量分别为95.22%、95.37%、97.22%、89.65%,不含蛋白质和还原性糖,是非淀粉类多糖。CCP60a和CCP60b分子量分别为234kDa和5.0kDa。紫外光谱分析,两种多糖在260nm和280nm未见核酸和蛋白吸收;经红外光谱分析可知,多糖CCP60a明显具有多糖的特征,且主要含α-糖苷键。GC测定,可知多糖CCP1主要由主要由葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gla)组成,并且还有少量的岩藻糖(Fuc);含量分别为77.42%、12.39%、7.37%和1.68%,其摩尔组成比大约为葡萄糖∶甘露糖∶半乳糖=10.5∶1.7∶1。多糖CCP60a主要由葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)组成。毛头鬼伞多糖CCP60a经完全甲基化后并进行GC-MS测定,并结合核磁共振氢谱(~1H NMR)和核磁共振碳谱(~(13)C NMR)分析,可知它主要由1,4-连接(取代)的α-D-吡喃葡萄糖组成,而且含有少量的1,2,6-连接(取代)的α-D-吡喃半乳糖,其摩尔数组成比为9∶1,其主链主要为1,4-连接(取代)的α-D-吡喃葡萄糖。多糖CCP60a可与刚果红发生颜色反应,但不能肯定多糖是否具有螺旋结构;也可与天青A发生反应。 (3)毛头鬼伞多糖对TMV有显著的控制作用,其中当多糖与病毒混和接种时,其对病毒的抑制率在90%以上。毛头鬼伞多糖对TMV侵染位点有保护作用,且能强烈地抑制病毒的增殖。 (4)对多糖CCP60a的抗TMV机理进行了研究。结果表明多糖对TMV病毒粒体形态结构无直接破坏作用,但对TMV-RNA侵染有明显的体外抑制作用,同时对TMV-CP的体外聚合有一定影响。喷施多糖CCP60a后,能诱导寄主POD、PPO、PAL、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶等防御酶活性的增加,可以诱导寄主体内SA含量的增加,并减轻病毒侵染对寄主叶绿体造成的破坏,从而提高寄主抵御病毒侵染的能力。Real Time PCR相对定量结果表明,经多糖处理的样品中的两个目的基因TMV-cp和TMV-replicase分别比未处理的样品基因表达量分别降低34%和32%,说明毛头鬼伞多糖可以使烟草寄主体内的RNA蓄积量降低。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S432.41;S482.2

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