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《福建农林大学》 2007年
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甘薯抗病相关基因的克隆与分析

陈观水  
【摘要】: 植物抗病基因克隆研究对于抗病育种和抗病机制的理解具有重要的意义。甘薯不仅基因组庞大,且重复序列含量丰富,这些特点使得利用经典基因克隆方法克隆甘薯抗病相关基因极其困难。目前,已经从10多种植物中分离到将近60多个针对细菌、真菌、线虫和病毒的抗病基因,但尚未有功能性甘薯抗病基因被克隆。虽然这些抗病基因各具特点,但是它们大多数具有保守的结构域,如NBS、LRR等,这为甘薯抗病基因的克隆研究提供了新的思路。 除抗病基因外,植物对病害防卫反应的另一种作用方式是植物防卫反应信号蛋白编码基因,如NPR1。NPR1基因是调控植物对病害防卫反应的一个关键基因。它不仅对植物系统获得抗性(systemic acquired resistance,SAR)和诱导系统抗性(induced systemic resistance,ISR)起核心调控作用,而且是植物基础抗性(basic resistance)以及由抗病基因(resistance gene,R)决定的抗性的重要调控因子。其过量表达可提高寄主对多种病害的抗性。已发现一些重要作物中都存在NPR1及其类似基因,NPR1及其类似基因介导的抗性可能是多种植物共同的保守途径。因此,NPR1及其类似基因在植物抗病基因工程中具有广泛的应用前景。 本论文主要研究内容包括:(1)根据其抗病基因保守结构域(P-loop和GLPL)设计简并引物,以高抗根结线虫病的甘薯栽培品种青农2号和近缘野生种三浅裂野牵牛基因组DNA为模板,用PCR扩增甘薯及三浅裂野牵牛NBS类抗病基因类似物(resistance gene analogues,RGAs),并对RGAs序列进行分析,揭示甘薯抗病基因的多样性、起源与进化关系;(2)以分离的甘薯RGAs序列为基础,用RT-PCR和RACE(Rapid amplification cDNA end)方法分离甘薯NBS-LRR抗病相关基因的全长cDNA序列,并对所获得的全长基因进行Southern杂交分析和初步的转录表达检测;(3)根据已克隆的拟南芥、烟草等植物NPR1基因的保守区域设计引物,利用RT-PCR和RACE方法分离到甘薯NPR1类似基因的全长cDNA序列,并对所获得的全长基因进行Southern杂交分析和初步的转录表达检测。主要研究结果如下: 1.根据已知植物抗病基因的保守区域(P-loop和GLPL)设计简并引物,共从抗根结线虫病甘薯品种青农2号和近缘野生种三浅裂野牵牛基因组DNA扩增出28条RGAs(其中甘薯22条,分别命名为IbRGA1~IbRGA22;三浅裂野牵牛6条,分别命名为ItRGA1-ItRGA6),在GenBank网站上的登录号分别为DQ251184、DQ272296、DQ272297、DQ303440-DQ303442、DQ341401-DQ341403、DQ341405-DQ341408、DQ377949-DQ377957、DQ849027-DQ849032。序列分析表明,28条RGAs编码的氨基酸绝大部分含有典型的NBS-LRR类抗病基因所共同拥有的保守性结构域P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域(HD),属于NBS-LRR类抗病蛋白,其中部分还与GenBank中已登录的马铃薯Gro1-4基因、番茄Mi-1、Mi-2、Hero、拟南芥RPM1等植物R基因具有很高的相似性,说明这些RGAs有可能为甘薯抗病基因部分片段。28条RGA序列之间核甘酸序列间的相似性在35.5%~99.4%之间变化,而相应推测的氨基酸序列间的相似性在13.8%~100%间变化,同时对分离的RGAs的核苷酸和氨基酸序列进行系统发育树分析,表明可明显分为TIR(Drosophila Toll or human interleukin recaptor-like)和nonTIR两类。通过对它们密码子组成与使用、同义替代(synonymous substitution)率(Ks)和非同义替代(non-synonymous substitution)率(Ks)的分析表明,甘薯NBS-LRR类RGAs与其他物种NBS-LRR类抗病基因可能具有同样的起源和进化机制。 2.在所分离的RGAs基础上,采用RACE技术获得了全长3200bp的甘薯抗病相关基因SPRl,该基因包括2667bp的开放读码框,编码888个通读的蛋白质氨基酸序列,基因编码产物具有NBS、LRR、HD等一系列抗病基因的保守结构。Southern杂交结果表明,SPR1基因在甘薯中具有2-4个拷贝。RT-PCR技术对该基因的转录表达情况研究表明,SPR1基因在甘薯中为组成型表达,其表达无组织特异性。初步认为甘薯SPR1基因为nonTIR-NBS-LRR类抗病相关基因。SPRl基因的编码产物为抗病相关蛋白,在结构上与拟南芥RPM1基因具有较高的相似性。目前SPRl基因已在GenBank上注册,登录号为EF428453。 3.根据已克隆的其他植物的NPR1基因的保守序列设计引物,从甘薯青农2号中获得了NPR1类似基因片段,根据获得的基因片段的序列设计RACE引物,通过RACE法获得了甘薯NPR1的全长基因cDNA序列,全长2353bp,包含1761bp的开放读码框,编码586个通读的氨基酸序列。通过序列分析发现甘薯NPR1基因推导的蛋白质都具有已知NPR1蛋白的典型保守结构域POZ/BTB和ANK。对已报道的拟南芥、烟草、番茄、水稻等植物NPR1与甘薯NPR1的氨基酸序列分析表明:对NPR1功能起关键作用的氨基酸在不同物种不同基因产物间均具有保守性,如npr1-1(H),npr1-2(C)和nim 1-4(R)。Southern杂交结果表明,SPR1基因在甘薯中具有1-2个拷贝。利用半定量RT-PCR研究水杨酸(SA)对甘薯NPR1基因的转录表达的影响,结果表明,SA可提高NPR1基因可提高甘薯NPR1基因的表达量。目前NPR1基因已在GenBank上注册,登录号为EF190039。 4.分别构建了甘薯SPR1和NPR1基因的真核表达载体,为进一步研究它们的功能打下了基础。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S531

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