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《福建农林大学》 2007年
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防治烟草赤星病根际芽孢杆菌的筛选及其抗菌物质研究

方敦煌  
【摘要】: 从健康烟草根际分离到669株根际芽孢杆菌,通过平板对峙培养、代谢产物活性检测,获得9株抑制烟草赤星病菌(Alternaria alternata)活性较强的菌株,其菌体及代谢粗提物产生的抑菌圈均在10 mm以上;离体防效和田间小区防治试验表明,B6、B75菌株的含菌发酵液和代谢粗提物的离体防效分别为75.6%、76.9%和62.5%、64.7%,小区防效分别为70.3%、75.8%和60.3%、64.4%。代谢粗提物的抑菌作用试验发现,B75菌株的代谢粗提物在一定浓度范围能抑制赤星病菌孢子萌发、菌丝生长与产孢。 采用生理生化、Biolog和16S rDNA序列测定,对筛选的一株烟草赤星病菌拮抗细菌B75菌株进行了鉴定,生理生化鉴定显示该菌株与Bacillus subtilis极为相似;Biolog鉴定显示其为B.subtilis;进一步对该菌株作16S rDNA序列测定与分析,表明其与己报道的B.subtilis具有99.8%的同源性,二者在所构建的系统发育树上处于同一个分支。因此确定B75菌株属于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。 以NB培养液对B75菌株进行培养试验,结果表明,B75在对数生长的中期开始产生抗菌物质,在生长的衰退期前存在一个产生抗菌物质的高峰期;在25~50℃、pH4.0~8.5范围内均可产生抗菌物质,其中30℃和pH6.0的培养条件下最适。不同的装液量试验结果表明,B75菌株在装液量为100ml/500ml三角瓶时是菌体生长及产生抗菌物质的最适宜量。不同的碳/氮源试验结果表明,甘露醇、酵母膏最有利于B75菌株菌体生长,且产生的抗菌物质抑菌活性较强。 枯草芽孢杆菌B75菌株发酵粗提液的抗菌物质可被饱和度为40%的硫酸铵完全沉淀。对该沉淀的部分理化性质研究发现,121℃处理30min,活性保持不变;在pH 4-8的范围内,随pH的增大,溶解度增大,但pH 8室温下存放24h,活性明显下降;用胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K处理,活性无明显降低。该沉淀用磷酸缓冲液溶解后,经Sephadex G25脱盐、Source 15 FLPC(fast protein liquidchromatography)、反相C18 HPLC (high performance liquid chromatography)多次分离、纯化,得到1个活性峰。取活性峰在Q-TOF2(electrospray ionization quadrupoletime-of-flight mass spectrometry)检测时发现有2个峰,分子量为分别为1463.81D、1477.82D。经Q-TOF2和ApexQ FF-MS(Fourier-transform ion cyclotron resonancemass spectrometry)分析,鉴定为芬枯草杆菌素(Fengycin)。 采用浓盐酸、硫酸铵沉淀枯草芽孢杆菌B75的无菌发酵液中的抗菌物质,磷酸缓冲液(50 mmol/L,pH 6.8)、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯8种溶剂提取菌体抗菌物质,并进行生物活性检测和HPLC分析。结果表明硫酸铵沉淀物的活性比浓盐酸强;甲醇、乙醇、乙腈、丙酮提取物具有抑菌活性,其抗菌活性显著低于浓盐酸、硫酸铵沉淀物;同一RP-HPLC条件下,硫酸铵沉淀的杂质比浓盐酸多,浓盐酸与硫酸铵沉淀物的活性峰无差异,甲醇、乙醇、乙腈、丙酮提取物的活性峰可完全重叠,比较发现浓盐酸与硫酸铵沉淀物的活性峰明显不同于菌体提取物。这些结果说明,枯草芽孢杆菌B75液体发酵的无菌滤液、菌体中均存在抗菌物质,且存在两者之中的抗菌物质明显不同:无菌滤液抗菌物质可溶于磷酸缓冲液,而菌体中的则不溶;两者在同一RP-HPLC条件下,出峰时间差异明显。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S435.72

【引证文献】
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9 王伟伟;枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶抗烟草花叶病毒活性及其酶学性质的初步研究[D];西北农林科技大学;2008年
10 周翠;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活性物质的分离和功能测定[D];山东农业大学;2011年
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