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《福建农林大学》 2007年
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灵芝中一种DNase的特征和MT基因序列分析

谢东扬  
【摘要】: 灵芝(Ganoderma lucidum)含有丰富的活性物质,是2000年《中华人民共和国药典》收录的重要中药品种。目前,以灵芝为材料的研究主要集中在多糖和小分子活性物质的提取及其功效方面,对功能性蛋白研究甚少。因此,从灵芝中发现新的活性蛋白和基因对提高灵芝的药理价值、拓宽其应用渠道具有重要作用。 本实验分为两个部分:Ⅰ、灵芝中一种脱氧核糖核酸酶的纯化及其生物活性分析。Ⅱ、灵芝金属硫蛋白的基因克隆和序列分析。 Ⅰ、灵芝中一种新的脱氧核糖核酸酶的纯化及生物活性分析: 1.分离纯化:主要通过硫酸铵盐析,亲和层析和离子交换层析方法从灵芝中分离纯化一种脱氧核糖核酸酶,命名为GLDNase。质谱分析其精确分子量为13807 Da,SDS-PAGE检测为单亚基多肽,等电点为pH6.6,糖含量为2.7%。 2.N端氨基酸序列分析:GLDNase的N端的氨基酸序列为PLDTGRYHIYTW/T/CDGG。在GeneBank中采用Blast分析没有找到N端氨基酸与其同源的多肽,说明GLDNase是一种新的蛋白质。 3.肽指纹图谱:经胰蛋白酶酶解后进行肽质量指纹谱的分析,得到两个肽段,其氨基酸序列分别为QVETVVDRLDELPIR和ESPGLQGVSSVPLR。序列分析表明这两个片段分别与DNA聚合酶Ⅱ和二氢硫辛酰胺脱氢酶的部分氨基酸序列存在较高的同源性。 4.脱氧核糖核酸酶活性分析:GLDNase可作用于超螺旋DNA,λDNA,ssDNA和dsDNA。通过对超螺旋DNA,λDNA的作用与时间的关系分析,GLDNase可将超螺旋DNA切割成环状DNA和线状DNA;降解λDNA时,没有产生特异性条带,说明GLDNase是一种非限制性内切酶。 GLDNase酶活性依赖于二价金属阳离子Mg~(2+),浓度为5mmoL·L~(-1)时活性最高;10mmoL·L~(-1)EDTA可完全抑制其酶活性;GLDNase最适pH范围为pH8.0-pH9.0,pH8.4时活性最高;40℃时酶活性最高。 利用磷酸二酯酶Ⅰ和磷酸二酯酶Ⅱ分析GLDNase水解DNA产物末端的基团为3′-OH,5′-磷酸。以上实验结果说明GLDNase与DNaseⅠ的酶活性质相似,属于DNaseⅠ家族的一个成员。 5.抗烟草花叶病毒活性:采用半叶法测定了GLDNase对TMV侵染心叶烟的抑制活性。GLDNase可明显抑制病毒枯斑,对TMV侵染心叶烟的抑制效果呈剂量—效应相关性。GLDNase可干扰TMV抗体与抗原之间的结合,对TMV外壳蛋白的抗原决定簇可能有一定的影响。 Ⅱ、灵芝金属硫蛋白基因克隆和序列分析 金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸、低分子量的重金属结合蛋白。金属硫蛋白具有很强的金属结合能力和氧化还原能力,在生物体内具有参与细胞内金属水平的调节,重金属解毒、清除自由基等重要的生物学功能。目前还没有关于灵芝金属硫蛋白基因的文献报道。 本文采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法获得了灵芝金属硫蛋白基因的cDNA序列。GeneBank登录号EF489399。 该序列全长为389bp,5′-端非翻译区为121bp,3′-端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp(包括一个终止密码子),可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸(Cys)含量最高,占21.2%,其次是丝氨酸(Ser)和丙氨酸(Ala),均占12.1%。其编码的氨基酸序列具有金属硫蛋白的保守序列模式cys-(x)_(1-3)-cys。表明该序列具有金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族的成员。灵芝与卷缘桩菇和双胞蘑菇的金属硫蛋白基因的同源性分别为80%和61%。灵芝金属硫蛋白基因序列的获得为深入研究金属硫蛋白家族的启动子,基因的表达及探讨其结构与功能的关系提供理论基础。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S567.31

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