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《福建农林大学》 2008年
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虫生真菌座壳孢的分离鉴定和代谢产物的活性研究

潘洁茹  
【摘要】: 座壳孢菌(Aschersonia)是粉虱和介壳虫的重要昆虫病原真菌。其生态适应性强、资源丰富,是研究生物多样性和系统发育很好的模式生物。目前全世界已报道了78种座壳孢,但这只是自然界座壳孢资源的一小部分。大量地分离和培养菌种资源才能有效地保存和利用资源及其基因库,因此菌株的采集和分类鉴定工作是座壳孢所有研究的基础。然而,座壳孢菌存在着杀虫速率缓慢、发生和传播受自然因素限制较大等缺点,这在很大程度上阻碍了该菌的应用。对该菌活性代谢产物的研究可为发展新型高效的真菌杀虫剂提供依据。因此,座壳孢菌资源的收集及其代谢产物的研究是该菌研究的重点,本文即针对这两个重要方面展开研究。 本研究以福建省武夷山市和建瓯市采集的65个座壳孢菌样品为研究对象,利用体视显微镜观察其子座的形状和颜色,通过切片方法获得各菌孢子大小和侧丝长度等特征的详细数据。分离纯化了形态差异较大的21株座壳孢,用斜面低温、液体石蜡和液氮保存这三种方法对分离的菌株进行了保藏。结果表明液氮保存方法最适合座壳孢菌的长期保存。通过形态观察和分生孢子、侧丝等数据分析,可以初步鉴定:Wys20和Wys29是粉虱座壳孢(Aschersonia aleyrodis Webber);Jos009是扁座壳孢(Aschersonia placeta BerkBvt);Jos56和Jos57是布鲁门拿维安文座壳孢(Aschersonia blumenaviensis P.Henn);Jos70是集座壳孢(Aschersonia badia Patouillard);Wys46、Wys47和Wys48是柱形座壳孢(A.columnifera Petch)。此外,还发现Wys23和Jos78两个形态较特殊的菌株。 对上述21株座壳孢、国外馈赠的4株座壳孢菌株和1株轮枝菌(Verticilliumsp.)的LSU rDNA部分序列进行了克隆和测序,获得约0.62 kb的序列,加上GenBank已报道的11株座壳孢LSU rDNA序列共37个采用PHYLIP软件包的邻位相连法(Neighbor-Joining)构建系统发育树并利用MEGA软件包计算各菌株间的遗传距离。结果表明:从武夷山和建瓯采集来的21株座壳孢菌株间LSUrDNA的序列的遗传距离很小(0.000-0.007),在系统发育树中聚为一组,与粉虱座壳孢最接近。通过对系统发育树和遗传距离的分析,得到以下结论:座壳孢种间的遗传差异大于种内的遗传差异;座壳孢菌株间的遗传差异与地理来源相关;LSU rDNA的序列分析可作为座壳孢菌形态鉴定的考证、差异较大的新种的鉴定和座壳孢属与其他属真菌的鉴别,但不能应用于其近似形态种和疑难种的区分。 进而选取野外抗旱性最好的菌株Jos009研究其代谢产物的抗菌活性、杀虫活性和抗菌作用机理,并比较了不同培养方式对其代谢产物活性的影响。结果表明,液体培养比固体培养更有利于活性代谢产物的产生。活性代谢产物有广谱抗细菌和病原真菌的活性,其对敏感细菌的最小抑制浓度(MICs)从37.5μgmL~(-1)到150μg mL~(-1)。活性代谢产物对多种植物病原真菌均有抑制作用,这些病原真菌包括:尖镰孢黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)、盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)和尖镰孢古巴专化型(Fusariumoxysporum f.sp.cubense)。其中对尖镰孢古巴专化型的抑制最为显著。此外,活性代谢产物对桃蚜(Myzus persicae)也表现很强的触杀活性,24 h和48 h半致死浓度分别为1.025和0.714 mg mL~(-1)。利用扫描电镜观察经代谢产物处理后的尖镰孢古巴专化型。结果表明,其代谢产物可直接作用于真菌细胞壁,产生一系列的形态畸形,包括菌丝的降解、起泡和扭曲。 采用活性追踪的方法对活性代谢产物进行分离和纯化,得到一种纯的化合物15α,22-二羟何帕烷。生物测定结果表明:15α,22-羟何帕烷对对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种8010菌株(Bacillusthuringiensis subsp.kurstaki 8010)、沙门氏杆菌(Serratia marcescens)和粘质赛氏杆菌(Salmonella typhimurium)表现出微弱的抑制作用,MIC均为500μg mL~(-1)。
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