水稻细菌性条斑病抗性QTL qBlsr5a的精细定位及候选基因的表达分析

【摘要】： 水稻细菌性条斑病(Xanthomonas campestris pv.Oryzicola),简称水稻细条病,是水稻上一种重要的检疫性细菌病害。该病主要危害水稻叶片,水稻受侵染后,叶片变黄甚至枯死,空秕粒增多,千粒重降低,一般可减产10%～20%,严重时达40%。目前,细条病已成为南方稻区的主要病害,成为影响水稻产量及品质的重要限制因子。相对于水稻另两大病害(白叶枯病和稻瘟病),水稻对细条病的抗性属于典型的数量性状,不存在主基因抗性,现有种质资源中也未发现对该病表现免疫的品种。因此,深入挖掘现有资源中的数量抗性基因座(Quantitative resistance locus,QRL),不仅具有重要的实践应用价值,而且可以对数量抗病性的机制研究提供帮助。 目前,在水稻中已报道13个细条病抗性QTL,其中Tang等以高抗细条病品种Acc8558和高感细条病品种H359为亲本构建的重组自交系群体,定位了11个细条病抗性QTL,其中位于5号染色体短臂上的QTL qBlsr5a(其抗病等位基因来自抗病亲本Acc8558)对表型变异贡献率最大,并在后续研究中得到了证实。这说明qBlsr5a在水稻细条病抗性的遗传改良上具有较大的应用前景。本研究在前人工作的基础上,对qBlsr5a进行更深入的研究。 分别以Acc8558和H359为供体亲本和受体亲本,通过回交和分子标记辅助选择,育成了只渗入供体5号染色体短臂含抗性QTL qBlsr5a的区段的近等基因系H359-BLSR5a。进一步将该近等基因系与H359杂交,建立了一个大的F2群体(2,265单株)。采用选择极端表型个体并验证其后代(F_(2:3))株系的方法,在F_2群体中鉴定出目标QTL为抗病纯合基因型的个体。通过对这些个体进行分子标记基因型检测和连锁分析,将qBlsr5a定位在SSR标记RMl53和RM159之间,大约2.4 cM或290 kb的范围内。 利用Affymetrix的基因芯片对抗病品种Acc8558和感病品种H359中受细条病菌侵染调控的基因进行高通量的检测。在两品种中共检测到956个差异表达基因,其中12个基因在两品种中一致上调,54个基因在两品种中一致下调,20个基因在两品种中表达变化方向相反。对差异表达基因的基因本性(GO)、代谢路径和启动子进行了分析。比较所有差异基因与已报道的13个抗性QTL的位置关系,发现有30个差异表达基因的位置与这些抗性QTL吻合,但在qBlsr5a的定位区间(290 kb)内只检测到一个差异表达基因(LOC Os05g01330),且功能未知。 在水稻Gramene(http://www.gramene.org/Oryza_sativa_japonica/contigview)及TIGR(http://www.tigr.org/tdb/e2kl/osal/GO.retrieval.shtml)数据库中查询,发现qBlsr5a的精细定位区间(290 kb)内共有51个预测基因,其中33个(64.7%)有功能注释。根据这些功能注释,我们选择了19个预测基因(包括那个基因芯片检测到的差异表达基因)进行表达分析,其中3个预测编码多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白前体(PGIP);1个编码锚蛋白1(ankyrin-1);1个编码转录因子ⅡAγ基(TFⅡAγ);1个编码与K蛋白1互作的锌指蛋白(ZIK1);还有2个含锌指结构。以H359和H359-BLSR5a为材料,在病原菌接种后的不同时期对这19个基因进行半定量RT-PCR分析。结果表明,有4个预测基因在两品系中都没有表达,7个预测基因在两品系中在病菌侵染前后表达都没有变化,其余8个预测基因对病原菌侵染有反应。其中6个基因的表达趋势在两品种中基本一致(5个表达上调,1个表达下调)。1个基因(LOC_Os05g01380)在H359中接种前后没有变化,但在近等基因系H359-BLSR5a中接种6h时表达量开始增强,到24h时表达量达最到高。最令人感兴趣的是预测基因LOC_Os05g01444,它在H359中没有表达,而在H359-BLSR5a中被诱导表达,且在接种6h时表达量达到最高。该基因编码区长度为1,206 bp,无内含子,预测编码多聚半乳糖醛酸酶抑制前体蛋白(PGIP),已知PGIP参与植物的多种抗病反应。因此看来,该基因是qBlsr5a的一个重要的候选基因。