草莓乙烯受体反义基因遗传转化的研究

【摘要】： 草莓(Fragaria ananassa Duch)是一种重要的小型浆果,在世界范围内广泛栽种,近年来育出很多优良品种,种植面积逐渐扩大。然而仍有很多因素限制了草莓生产的发展,其中一个重要难题就是草莓果实难以保鲜、不耐贮运。基因工程技术为植物育种、种质资源开发利用等领域开辟了新的途径,可以获得常规育种难以或无法得到的新类型。 果实成熟是一个复杂的生理生化过程,而乙烯是引发果实成熟的主要因素之一。乙烯能从其生物合成和感知与信号转导两方面进行调控,相对于人们对乙烯生物合成途径的了解而言,有关植物感知乙烯及其信号转导机制的知识了解甚少,目前对乙烯信号转导的研究主要集中在拟南芥上。草莓是非跃变型果实,也能产生乙烯,某些情况下乙烯可能参与草莓的成熟,乙烯和草莓成熟之间的关系,不同的试验得出的数据彼此矛盾,目前并没有明确的结论,至今没有结果明确表明乙烯和非跃变型果实成熟的关系。乙烯感知和信号转导的初始成分是乙烯受体,乙烯的生理作用最终是通过乙烯受体及其信号转导过程完成的。目前草莓上分离出3个乙烯受体基因,本试验采用反义RNA技术试图了解乙烯在草莓果实成熟衰老中的作用及这些乙烯受体的功能和作用方式。 本试验对草莓组织培养体系进行了系统研究,优化了农杆菌介导的草莓遗传转化体系。构建了草莓反义乙烯受体表达载体pBI121Etr1、pBI121Ers1和pBI121Etr2及同时含有草莓乙烯受体FaEtr1和FaErs1的双价植物表达载体pFRS,用于转化草莓,成功的获得了转基因植株,并进行了相关分子生物学鉴定,获得反义转基因材料对探讨乙烯受体作用以及乙烯在草莓等非跃变型果实成熟的调控机理具有重要意义,也为后续研究提供了宝贵的试验材料。 1.在已报道的FaEtr1、FaErs1和FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,分别克隆草莓乙烯受体FaEtr1基因580bp部分特异序列、FaErs1基因445bp部分特异序列和FaEtr2基因345bp部分特异序列,将上述3个片段分别反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35s启动子和Nos终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr1、pBI121Ers1和pBI121Etr2。将带有完整启动子和终止子的FaEtr1和FaErs1基因引入pCAMBIA2301中,最终获得FaEtr1和FaErs1的双价植物表达载体pFRS。通过PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pBI121Etr1、pBI121Ers1、pBI121Etr2和pFRS。将这4个重组表达质粒导入根癌农杆菌EHA105中,PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。 2.以‘丰香'、‘鬼露甘'、‘全明星'、‘嫜姬'、‘哈利'、‘幸香'6个草莓品种为试材,研究了影响草莓不定芽再生的各种因素,建立离体叶片高效再生系统。结果表明,外植体基因型、植物生长调节剂种类及配比、叶龄等是影响草莓再生的主要因子。其中‘鬼露甘'叶片最佳芽诱导培养基为MS+6-BA2.0mg·L~(-1)+IBA0.1mg·L~(-1),‘嫜姬'叶片愈伤组织的诱导以MS+6-BA3mg·L~(-1)+2,4-D0.2mg·L~(-1)较好;芽伸长的最适培养基为MS+6-BA0.5mg·L~(-1)+IBA0.5mg·L~(-1);生根的最适培养基为MS+IBA0.2mg·L~(-1),试管苗移栽后成活率为87%。另外,1W左右的暗培养可以防止外植体的褐化。 3.利用带有内含子的gus基因的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导‘鬼露甘'草莓遗传转化的若干因素。结果表明:草莓叶片外植体对卡那霉素较为敏感,适宜的筛选浓度为20mg·L~(-1),可明显抑制非转化组织的生长;300mg·L~(-1)的羧吩青霉素可有效抑菌,对外植体生长影响也较小;预培养2-4d有利于转化;共培养2-3d有利于提高转化频率并避免了农杆菌的过度生长;OD_(600nm)值为0.4的菌液侵染10min效果最佳。再生植株经PCR检测初步证明gus基因已成功整合到草莓基因组中。 4.通过根癌农杆菌EHA105将含有反义FaEtr1和FaErs1基因的双价植物表达载体pFRS导入草莓,经卡那霉素选择压下连续分化选择、扩繁和生根培养并经PCR和Southern blot检测证明,其中15株的基因组已成功导入和整合反义FaEtr1和FaErs1基因。Northern分析表明,转入的反义基因对靶基因都有部分的抑制。 通过根癌农杆菌EHA105将含有反义FaEtr2基因的植物表达载体pBI121Etr2导入草莓,经卡那霉素选择压下连续分化选择、扩繁和生根培养,并经PCR和Southern blot检测证明,其中26株的基因组已成功导入和整合反义FaEtr2基因。Northern分析表明,转入的反义基因对靶基因有部分的抑制。 5.对转基因植株叶片部分器官的乙烯释放量,呼吸强度以及叶片脱落进行了检测。相对于对照而言,转基因植株叶片部分器官的乙烯释放量降低,转反义FaEtr2基因叶片乙烯释放量降低更明显。乙烯处理这些植株,叶柄脱落变缓,转反义FaEtr1和FaErs1双基因植株叶片脱落要比转FaEtr2基因植株叶片脱落慢。