辣椒应答逆境的转录谱分析及相关候选基因cDNA分离与鉴定

【摘要】： 辣椒(Capsicum annuum L.)是我国重要的蔬菜以及工业加工原料作物,近年来发展辣椒生产已经成为我国各地农业增效和农民增收的一条有效的途径,但在栽培过程中,各种生物与非生物产生的逆境胁迫,对辣椒的产量与品质造成严重的影响。近十年来,有关植物适应逆境的分子机制方面已经进行了大量研究,发现植物对不同的逆境胁迫的防御反应及其信号传递之间相互关联,各种内源激素参与了植物应答不同逆境的信号传递并彼此之间关联,但人们对基因组水平上各种内源激素在植物应答逆境防御反应中作用机制的认识还相当有限。本研究着眼于了解辣椒响应逆境胁迫的分子机制,使用cDNA-AFLP技术获得辣椒在部分逆境胁迫下的表达谱;使用抑制消减文库技术获得部分辣椒在紫外线B(UV-B)或辣椒疫霉(Phytophthora capsici.)胁迫下特异表达的基因;使用cDNA文库构建技术和基因克隆技术获得若干响应逆境胁迫的候选基因;使用荧光定量技术检测这些候选基因在部分逆境下的表达情况;使用Gateway载体构建技术构建若干候选基因的植物表达载体;采用农杆菌介导的转基因方法将这些候选基因的表达载体转化到烟草中,为继续进行辣椒抵抗逆境的分子生物学与分子生态学研究奠定基础。本研究的主要结果如下: 1)通过cDNA-AFLP技术分析辣椒幼苗响应多种胁迫的表达谱。利用ApoI/MseI组合UV-B、辣椒疫霉、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、水杨酸(salicylicacid,SA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、乙烯(ethylene,ET)、水杨酸+脱落酸等7种类型样品进行了酶切,用筛选出的86对引物组合对酶切产物进行了选择性扩增,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,共产生接近5000个条带,条带基本分布在50-1000 bp之间,选取约400条明显发生变化的转录衍生片段(transcript-derived fragment,TDF)进行测序,测序成功363条,对这些TDFs进行了Blast分析、GO分析、Enzyme分析、表达情况及功能聚类分析。 2)采用PCR-Select抑制消减文库试剂盒,构建了辣椒响应UV-B照射、辣椒疫霉侵染的抑制消减文库,对文库进行部分测序获得响应UV-B照射而特异表达的基因片段14个(过氧化氢酶、伴侣蛋白60b、WRKY家族转录因子、蛋白磷酸酯酶2C、ycf2蛋白、钾通道蛋白、亮氨酸拉链蛋白、核内小分子核糖核蛋白、光系统IP700脱辅蛋白质、类反转录蛋白、电子载体铁离子结合蛋白),响应辣椒疫霉侵染的而特异表达的基因片段12个(肽酶复合体clp亚基、类氮同化控制蛋白2、甲硫氨酸合成酶、磷酸核酮糖激酶前体、核酮糖磷酸羧化酶、叶绿素a/b结合蛋白、40s核糖体蛋白s11、核糖体蛋白132、PSTVd RNA结合蛋白、顺玉米素葡萄糖基转移酶、60s核糖体蛋白17、富亮氨酸跨膜蛋白),对这些片段进行了Blast分析、GO分析、Enzyme分析,InterProScan分析。 3)采用SMART~(TM)cDNA文库构建试剂盒,分别构建了响应JA与SA联合处理、UV-B照射和辣椒疫霉侵染的辣椒幼苗cDNA文库,经统计,这3个文库的原始滴度约在1.2-2.0×10~6 pfu/ml之间,扩繁文库滴度约在2-3×10~9pfu/ml之间,重组率都大于90%,达到了合格cDNA文库质量要求。 4)选择在逆境下表达发生改变的TDF序列进行引物设计,并采用基于PCR技术的96孔板cDNA文库筛选法,获得了8个辣椒响应逆境的候选基因cDNA全长,经生物信息学分析,推测这8个基因的表达产物为果胶甲基酯酶抑制因子(EU380203)、硫素蛋白(EU367112)、抗菌蛋白(EU401721)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活化酶(EU401722)、亲环蛋白(EU401723)、叶绿素a/b结合蛋白(EU401724)、非特异性脂转移蛋白(EU401725)、铁氧还蛋白(EU401726)。 5)通过实时荧光定量PCR法,对果胶甲基酯酶抑制因子、硫素蛋白、抗菌蛋白、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活化酶、亲环蛋白、叶绿素a/b结合蛋白、铁氧还蛋白核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活化酶小亚基等8个候选基因在9种类型(UV-B、辣椒疫霉、JA、SA、JA+SA、NaCl、4℃、机械损伤、蚜虫取食)处理的辣椒幼苗中的表达情况进行检测,获得了这7个候选基因在各种处理中的相对表达量及变化情况。 6)利用已克隆的果胶甲基酯酶抑制因子、硫素蛋白、抗菌蛋白、亲环蛋白、铁氧还蛋白、非特异性脂转移蛋白、乙烯应答元件结合蛋白、白藜芦醇合成酶等8个候选基因克隆,通过Gateway载体构建技术分别构建了各自的入门载体和植物表达载体。建立了高效的农杆菌介导的烟草遗传转化与再生体系,8个候选基因的表达载体通过农杆菌EHA105对烟草进行了遗传转化。