乌饭树叶中黄酮等有效成分分析及抗肿瘤作用研究

【摘要】： 乌饭树(Vaccinium bracteatum Thunb.)为杜鹃花科(Erioaoeae)越桔属(Vaccinium)植物,又名南烛、乌饭子、染菽等,是一种药用植物。国外将乌饭树叶有效成分应用于食品添加剂与眼疾治疗物;我国中医认为,乌饭树嫩叶取汁制成的乌饭药食兼具有轻身明目,黑发驻颜,延年益寿的功效。本研究主要着眼于乌饭树叶黄酮等有效成分分析及抗肿瘤作用的研究,对比不同干燥方法对乌饭树叶有效成分、主要营养成分及外观品质的影响,利用响应面分析法优化乌饭树叶黄酮的提取条件,探讨超临界CO_2萃取乌饭树叶黄酮的参数条件,利用动物试验阐明乌饭树叶乙醇提取物的急性毒性及其抗肿瘤作用,结合高速逆流色谱(HSCCC)与HPLC技术实现对抗肿瘤活性成分——槲皮素的分离。主要结果如下: 1.采用热风烘干、自然晾干、真空低压干燥、真空冷冻干燥4种方法处理乌饭树叶新鲜原料,对比不同处理方法对乌饭树叶有效成分(黄酮、黄酮苷、多酚、单宁)、主要营养成分(可溶性蛋白质、可溶性糖、粗脂肪)及外观品质的影响,分析了乌饭树叶不同生长期的有效成分及主要营养成分的变化趋势,以及黄酮类物质的生长部位分布规律与地区性差异。结果表明,真空冷冻干燥对乌饭树叶有效成分、主要营养成分及外观品质的影响最小;从生长时期来看,秋季采收的乌饭树叶除多酚含量下降2%外,其他成分(可溶性蛋白质、可溶性糖、粗脂肪、黄酮、黄酮苷、单宁)的含量都较春夏两季的要高。不同产地、不同采摘时间的乌饭树叶的黄酮苷含量差异明显(p＜0.05),乌饭树叶的枝条含有少量的黄酮苷,试验中原料含水率在0.1～0.5%,采摘时间以6～9月为宜,原料产地选择福州鼓岭。 2.从经济安全的角度出发,选择乙醇为提取溶剂,采用单因素试验、部分析因试验以及中心组合试验、响应面分析法对有机溶剂浸渍提取乌饭树叶黄酮进行了深入研究,分析乌饭树叶乙醇提取物的主要成分及乙醇提取物活性成分的热稳定性。试验结果表明:乙醇浓度和提取温度是影响乌饭树叶黄酮提取量的关键因子,乌饭树叶黄酮的最佳工艺条件为:提取前浸泡60 min,液料比50:1,乙醇浓度86.7%,提取温度61℃,提取时间2h,在此条件下一次提取率可达68.12%。乌饭树叶乙醇提取物的主要成分中黄酮类物质所占比重较大(20.76%)。此外,提取物中还含有8.82%的单宁。所采用的提取温度(61℃)对乙醇提取物中黄酮类成分——槲皮素没有影响,较高提取温度(70℃)对槲皮素有破坏作用。 3.采用单因素及正交试验寻找超临界CO_2萃取乌饭树叶黄酮的最佳条件,首次探讨了夹带剂、夹带剂浓度及用量对乌饭树叶黄酮提取量的影响,并对比超临界萃取法与有机溶剂浸渍法的黄酮提取率及提取物的成分。试验结果表明,最佳的超临界CO_2提取条件为:萃取压力16MPa,萃取时间1.5h,萃取温度50℃,夹带剂乙醇浓度75%,CO_2流量20 kg/h,夹带剂添加量5mL/g。将夹带剂添加到乌饭树叶的超临界CO_2萃取中,在一定程度上提高了黄酮的提取量,但并没有将大部分的黄酮都提取出来。HPLC分析表明超临界萃取法较有机溶剂浸提法可以提取更多的化学成分,但黄酮提取率与有机溶剂浸提法相比还差11%左右。 4.以乌饭树叶乙醇提取物(主要含黄酮类化合物)进行小鼠急性毒性试验。研究结果表明,采用DAS ver1.0 Bliss法计算出的乌饭树叶乙醇提取物的LD_(50)为39.1g/kg,其95%可信限为36.8～41.6g/kg,未见急性毒副作用,该提取物临床应用安全。 5.以环磷酰胺(CTX)为阳性对照组,以生理盐水为阴性对照组,观察各剂量乙醇提取物对实体瘤(U14)和腹水癌(S180)的抑制作用。结果表明,高剂量的乙醇提取物能显著抑制小鼠宫颈癌细胞株(U14)的生长(p＜0.05),抑制率达28.76%,而中、低剂量的乙醇提取物对小鼠宫颈癌细胞株(U14)没有抑制作用。高、中和低剂量的乙醇提取物均不能抑制小鼠腹水癌(S180)的生长。 6.采用近年来备受关注的高速逆流色谱分离技术实现乌饭树叶乙醇提取物有效成分的分离纯化,并结合高效液相色谱技术鉴定分离物——槲皮素及其纯度。结果表明,经过薄层色谱初筛后得到氯仿-甲醇-水(4:3:2)和氯仿-甲醇-正丁醇-水(5:1:3:1)两个溶剂系统。氯仿-甲醇-水(4:3:2)溶剂系统对乙醇提取物分离效果较好,得到的馏分A的紫外-可见吸收光谱图与槲皮素标准品的相似,通过面积归一法计算其纯度达98.3%,而采用氯仿-甲醇-正丁醇-水(5:1:3:1)溶剂系统,收集得到馏分A属于混合物质,经高效液相色谱分离,得到两个主要成分1、2,其中含量较大的成分1与标准谱图对照,也证明是黄酮类物质——槲皮素。