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银耳生物反应器的基础研究

孙淑静  
【摘要】: 本研究以银耳芽孢为材料,进行如下研究:采用分子标记筛选确定用作转化的银耳受体菌株;优化电激转化条件;构建蘑菇gpd启动子调控的egfp基因银耳表达载体,验证egfp基因在银耳中的表达;克隆银耳自身的gpd启动子,利用egfp基因验证银耳的启动子活性;构建银耳gpd启动子调控人胰岛素基因银耳表达载体转化银耳。具体结果如下: 1银耳受体菌株的筛选 菌株筛选结果表明,采用ISSR和RAPD两种分子标记,三个引物将14个菌株分为五类,其中第V类包含的9个菌株在DNA水平上没有任何差异,说明银耳菌种同种异名现象比较严重。根据树状分析图挑选出有一定差异的5个菌株,衡量生长速度,测定各菌株芽孢产量,结果表明T0006产量最高,生长速度最快,T0001和T0026次之。但经抗药性测定,T0006对卡那霉素和潮霉素有抗性,T0001对潮霉素敏感性较强,因此根据以上初步筛选的结果最后确定T0001作为转化受体菌株,潮霉素为筛选标记。 2高效电激转化体系的建立 以T0001作为转化受体菌株,影响菌株T0001的电激转化条件的实验结果表明,菌株T0001的电激转化需要先对芽孢进行预处理才能获得转化子,用2%溶壁酶处理1h效果最佳。电压300伏,电阻600欧姆,电容25微法为菌株T0001的最适转化条件。此外,我们在电激缓冲液中加入浓度为7%PEG4000时,转化率得到较大提高,达到9.25×10~6个/μg质粒DNA。 3蘑菇gpd启动子调控egfp基因银耳表达载体的构建及表达初探 以质粒pCAMBIA1300和pEGFP为出发质粒,构建了带有双孢蘑菇gpd启动子、Tnos终止子及egfp基因的片段的表达载体pCB-BEGFP,采用以上优化后的电激条件利用电激介导转化法,把携带egfp基因的银耳表达载体pCB-BEGFP导入菌株T0001中,验证egfp基因在菌株T0001中的表达情况。转化获得了大量的转化子,通过对转化子的PCR检测(包括egfp基因、Tnos终止子),证实了egfp基因已整合到转化子基因组DNA中。转化子用蓝光激发,在荧光显微镜下发绿光及其蛋白电泳表明,双孢蘑菇gpd启动子在银耳芽孢中可以很好的调控外源基因的表达,egfp基因在银耳中得到表达。 4银耳3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpd)基因及其启动子的克隆及功能初步分析 采用根据gpd氨基酸序列设计的简并引物,以菌株T0001总RNA为模板,逆转录PCR克隆了3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA,该序列长1008bp,编码的蛋白含有336个氨基酸残基,与9种真菌3-磷酸甘油醛脱氢酶氨基酸序列进行比对,相似性达81.52%。通过Tail-PCR方法克隆了该基因的长度500bp的启动子区域,序列分析表明片段含有TATAAA盒,位于转录起始位点“A”上游25位置,还含有其它很多有关启动子的元件和因子。构建了含有此启动子区域及gus基因的银耳表达载体TGP1301,电激转化菌株T0001,随机挑取的5个转化子,GUS活性检测,有4个变为浅蓝色,初步证明该启动子有驱动外源基因在菌株T0001芽孢中表达的能力。 5利用egfp基因研究银耳的启动子活性 利用egfp基因研究银耳的启动子活性结果表明:成功构建了含有银耳gpd启动子及egfp基因的银耳表达载体pCB-TEGFP,根据以上电激转化条件转化银耳芽孢,载体pCB-TEGFP被转入菌株T0001基因组中;转化子蓝光的激发下,荧光显微镜观察到很强的绿光;荧光光谱测定两个转化子最大荧光激发波长Ex分别为492nm和484nm,最大荧光发射波长Em都为510nm;转化子蛋白SDS-PAGE电泳,转化子的蛋白与阴性对照相比,在大约27kDa与预期的蛋白分子量相近处有一明显的蛋白条带出现。这些结果表明egfp基因在银耳芽孢中正确表达,克隆的银耳gpd启动子具有很好的调控外源基因在银耳中表达的能力。 6人胰岛素基因转化银耳及分子检测 将银耳gpd启动子试用于启动药用蛋白基因,构建了携带银耳gpd启动子及人胰岛素基因的银耳表达载体pCB-TBCA400,利用电激介导转化法,把携带人胰岛素基因的银耳表达载体pCB-TBCA400导入菌株T0001中,获得了大量的抗性菌株。通过对抗性菌株进行抗性鉴定、PCR检测证实了外源基因已整合到抗性菌株基因组DNA中。胰岛素基因在菌株T0001芽孢中的表达有待于进一步验证。


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