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《福建农林大学》 2008年
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蜜蜂球囊菌cDNA文库的构建及胞外酶的定性研究

赵红霞  
【摘要】: 蜜蜂白垩病(bee chalkbrood disease)是由蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)引起的真菌性传染病,主要感染蜜蜂幼虫。白垩病是我国养蜂业中潜在病害之一,影响着我国养蜂业的发展。目前国内外对蜜蜂球囊菌的研究主要集中在病原的生物学特性、最适培养条件、发病流行规律、病理学、病情的诊断等方面,由于蜜蜂球囊菌的致病机理不明,不能在生产中有效的预防和治疗蜜蜂白垩病。我们采用Stratagene公司的ZAP Eepress(?)cDNA Synthesis Kit and ZAP Express(?)cDNA Gigapack(?)ⅢGold Cloning Kit试剂盒,构建了蜜蜂球囊菌cDNA文库。文库滴度测定为10~6 pfu·mL~(-1),扩增后的滴度是10~9 pfu·mL~(-1);噬菌体的转化后,蓝白斑筛选单菌落,重组率达到90%。这为后续工作的进行打下良好的基础。昆虫中肠围食膜主要由蛋白质、几丁质和糖类等组成。蜜蜂球囊菌通过分泌胞外蛋白酶、几丁质酶、酯酶和淀粉酶等破坏蜜蜂幼虫中肠围食膜侵染蜜蜂;本试验对几种常见的蛋白酶、酯酶和淀粉酶分别进行活性染色和银染,结果显示:蜜蜂球囊菌能够胞外分泌蛋白酶、酯酶和淀粉酶。在SDS-PAGE条件下,蛋白酶活性染色有两条条带,分子量为37.0 kDa和110.0 kDa;酯酶活性染色鉴定出三条带,分子量是14.1 kDa、20.1 kDa、29.0 kDa。在PAGE条件下,蛋白酶有两条条带,分子量为48.0 kDa和94.0 kDa;酯酶活性鉴定出一条带,分子量是35.0kDa淀粉酶活性鉴定出至少三条带,分子量为90.0 kDa、97.2 kDa和大于97.2 kDa。此外,我们还对球囊菌分泌几丁质酶的情况进行了探索。利用蜜蜂球囊菌胞外分泌物(几丁质结合蛋白)结合胶体几丁质(N-乙酰葡糖氨),设计不同结合时间、不同缓冲体系,进行结合蛋白试验,然后结合后进行Loading buffer和Calcofluor(M2R)处理;pH 7.4条件下结合6 d,Loading buffer处理的效果好,同时得出Loading buffer比Calcofluor(M2R)处理效果好。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S895.137

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