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《福建农林大学》 2008年
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花生果、种皮特异表达基因的鉴定及其启动子的克隆

赵永莉  
【摘要】: 花生是我国重要的油料和经济作物;花生种子是花生的收获目的物,生长在土壤中的花生种子很容易受到土壤病虫害特别是黄曲霉菌的侵染,而严重影响花生产品的安全性。目前单纯通过常规育种的方法提高花生的抗黄曲霉病性难度大,而通过基因工程技术则可有效解决问题;但是目前转基因植物外源抗病基因的非特异性表达又带来了食品安全性问题。本研究是在已分离到的果、种皮特异表达基因的基础上,进一步分析这些基因在花生果皮、种皮和种仁等器官的不同发育阶段的表达模式,以及在其他不同器官的表达量,获得只在果、种皮特异或丰富表达的基因;然后克隆花生果种皮特异表达启动子,以便今后用于调控外源抗性基因只在果种皮中表达,而不在种仁中表达,确保转基因花生食品的安全性。 1.利用半定量RT-PCR技术分析了13个基因在花生果皮、种皮和种仁等器官不同发育阶段(10 d,20 d,30 d,40 d,50 d和60 d)的表达模式。13个果种皮基因中,有7个基因(8#、9#、13#、16#、8A4R19G1、PSC11和1O10)在果种皮的扩增条带亮于在种仁的,其他6个基因(12#、14#、2N22、4F2、5C22和9A4R19GZ)无明显差异。通过比较7个基因在果、种皮各个时期的扩增条带,最终获得在果皮中丰富表达而在种仁中不表达的特异基因2个,即8#和8A4R19G1。通过Blastn分析,其中8#基因是功能未知基因,8A4R19G1与陆地棉、粉蓝烟草和油桐等植物的水通道蛋白有同源性。经过推测氨基酸序列,预测8A4R19G1为主体水通道蛋白基因。 2.利用半定量RT-PCR技术分析了8#、9#、13#、16#、8A4R19G1、PSC11和1O10在花生不同器官(根、茎、叶、花和果针)的表达量。结果表明:8#、9#、13#、16#、8A4R19G1分别在这些器官未见扩增条带;PSC11和1O10各在根和叶中可见扩增条带,在其它器官则未见扩增条带。 3.根据已获得的8A4R19G1基因序列,采用TaKaRa LA PCR~(TM)in vitroCloning Kit克隆了其5′上游607bp核苷酸序列,通过生物信息学分析,在这个序列中找到了起始转录位点和一些基本启动子元件CAAT-box、TATA-box等。在进一步获得更长的启动子后鉴定该启动子的功能,将可在花生转基因安全的前提下,提高花生荚果的抗黄曲霉病性。 4.采用5′RACE获得花生PSC11基因的5′端序列。利用“Kozak”规则以及ORF Finder分析,找到了其起始位点ATG。为进一步获得其启动子序列奠定了基础。 目前,花生生物技术发展不够迅速,花生分子生物学研究总体来讲比较薄弱。通过本研究可以扩大我国花生基础理论研究的范围;研究结果为花生抗黄曲霉基因工程研究奠定了基础。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q943.2;S565.2

【参考文献】
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