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《福建农林大学》 2009年
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双T-DNA共转化获得转基因番木瓜的研究

何玮毅  
【摘要】: 番木瓜采后贮藏期间和鲜切加工后的迅速软化所导致果实的腐败变质,已成为制约其商品化生产的重要因素。在前人对番木瓜进行采后生理研究与反义ACS和ACO基因遗传转化的基础上,本文从中锁定了与番木瓜果实后熟软化密切相关的关键细胞壁水解酶β-GAL,从分子水平再次探讨了其与番木瓜果实软化的关系。通过构建含果实特异性启动子的RNAi双T-DNA植物表达载体,经由农杆菌介导转化番木瓜胚性愈伤组织,获得了共转化转基因再生植株,为进一步选育生理上可以正常成熟、且适于鲜切加工的无选择标记基因抗软化转基因番木瓜奠定基础。主要结果如下: 1.建立了适于番木瓜遗传转化的体胚发生系统。以‘漳红’番木瓜组培苗的叶片和叶柄为外植体,在改良MS + 0.5 mg·L~(-1) KT + 1.0 mg·L~(-1) 2, 4-D + 0.5 mg·L~(-1) BA + 0.1 mg·L~(-1) NAA + 400 mg·L~(-1) Glu + 30 g·L~(-1)蔗糖的固体培养基上诱导出了胚性愈伤组织。其中,CⅡa型胚性愈伤在一定条件下能够继代增殖,并能向CⅡb型转变,CⅡb型胚性愈伤则容易发生体胚。采用两步生根法,将胚性愈伤所形成的体胚再生植株先接种于1/2 MS +0.5 mg·L~(-1) IBA + 1.0 g·L~(-1) AC + 30 g·L~(-1)蔗糖的固体培养基中暗培养7天后,转移至1/2 MS + 1.0 g·L~(-1) AC + 25μM·L~(-1) VB12 + 30 g·L~(-1)蔗糖的固体培养基上光照培养,生根效果最好。移栽成活率可达45%以上。 2.克隆并分析了番木瓜果肉中第一类β-Gal基因。通过一对简并引物,研究番木瓜果实后熟软化过程中β-Gal基因家族表达水平的总体变化趋势,从分子水平证实了β-GALs与番木瓜果实软化的相关性,并从50%成熟度果实中克隆了果肉加速软化时表达丰度最高的第一类β-Gal基因。分离了该类β-Gal基因4501 bp的基因组序列,经比对,其共含有17个内含子,外显子部分核苷酸序列与GenBank中的cDNA只有1个碱基的差异。生物信息学分析结果表明,该番木瓜β-GAL属于糖苷水解酶超级家族42中家族35的成员,在进化过程中与拟南芥具有较近的亲缘关系,与鳄梨和北美云杉则关系较远。同时,它还具有一段定位于胞外的信号肽,推测它可能参与细胞壁的降解。 3.分离了番木瓜第一类β-Gal基因启动子,并进行了初步的功能鉴定。利用反向PCR技术,分离了第一类β-Gal基因1143 bp的5'端调控序列。在线预测结果表明,该片段含有核心启动子元件TATA盒,转录起始位点在起始密码子上游-133处。同时,还发现了与如乙烯等植物激素和胁迫应答元件,根部和胚胎器官特异性元件,以及增强子区域。利用该片段取代pCAMBIA 1301载体上GUS基因前的CaMV 35S启动子,经由农杆菌EHA 105介导侵染番木瓜不同组织器官,发现其具有明显的启动子功能,为伤诱导类型,并与特定器官的发育相关。GUS活性在果肉中最强,其次为胚和根部,其它器官中则不表达。 4.构建了用于番木瓜遗传转化的植物表达载体。将β-Gal基因保守区反向重复插入载体pKANNIBAL构建RNAi中间表达载体pKAN/RG。将其上发夹结构取代经改造的载体pCAMBIA 1300上hptⅡ基因,构建中间表达载体p1300-/MFRG。分离其上单T-DNA区段,与载体pCAMBIA 2301构建RNAi双T-DNA植物表达载体p2301/TTRG。将两端含有BamHⅠ和SalⅠ粘性末端的β-Gal基因启动子片段、p2301/TTRG经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切后的大片段和p2301/TTRG经XbaⅠ和SalⅠ双酶切后的小片段相连接,构建含有果实特异性启动子的RNAi双T-DNA植物表达载体。酶切分析和PCR检测表明,p2301/TTRG和p2301/BPTTRG均被成功导入农杆菌EHA 105,可用于后续的遗传转化研究。 5.开展了以携带植物表达载体p2301/TTRG的农杆菌EHA 105介导的番木瓜遗传转化方法和体系优化的研究。探索了液体振荡转化法、浸泡转化法、体胚针刺法和茎段转化对番木瓜转化效率和共转化效率的影响,以前两种方法的效果较好,以浸泡转化法的“100μmol·L~(-1) AS +菌液OD为0.2 +侵染20 min +共培养2 d”为本试验的最佳转化组合;“100μmol·L~(-1) AS +菌液OD为0.2 +侵染20 min +共培养3 d”为最佳的共转化组合。后两种方法则不太适于番木瓜的遗传转化。最终,获得了5株转基因再生植株,经PCR和Southern杂交检测结果表明,只有2株为共转化的结果,诱导了其中1株生根并移栽。 6.开展了番木瓜转BPTTRG基因和转MFRG的初步研究。利用浸泡转化法,以携带植物表达载体p2301/BPTTRG和p1300-/MFRG的农杆菌EHA 105,分别侵染CⅡb型胚性愈伤组织。前者获得了经GUS染色、PCR检测和Southern杂交结果为阳性的共转化转基因番木瓜再生植株。后者从198株再生植株的62个DNA混合池中,PCR检测出了两个阳性池。进一步对混合池中的单株分别进行PCR检测,则未能成功分离出转基因植株,在不含抗生素选择压的条件下的遗传转化可能出现了嵌合体现象。 以上研究获得的双T-DNA共转化的转RNAi-β-Gal基因番木瓜植株,有望通过一次有性杂交,选育无选择标记基因的抗软化转基因番木瓜,在一定程度上解决转基因食品的安全性问题。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S667.9

【引证文献】
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1 郭芹;王吉德;李雪萍;陈维信;吴斌;;一氧化氮处理对采后番木瓜果实乙烯生物合成的影响[J];广东农业科学;2013年03期
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1 胡恒;番木瓜环斑病毒(PRSV)ci和nib反向重复结构表达载体的转化研究[D];华中农业大学;2011年
2 袁欣捷;番木瓜环斑病毒CP基因IR表达载体的转化及抗病性研究[D];华中农业大学;2011年
3 赵新伟;番木瓜类胡萝卜素生物合成途径部分酶基因cDNA的克隆与分析[D];福建农林大学;2010年
4 叶一江;多花水仙类胡萝卜素生物合成途径部分酶基因的克隆与分析[D];福建农林大学;2012年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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9 陈昆松;张上隆;;果实成熟衰老功能基因研究与调控[A];中国园艺学会第四届青年学术讨论会论文集[C];2000年
10 刘成明;梅曼彤;;无患子科果树植物DNA的高效提取及RAPD分析体系的优化[A];中国园艺学会第五届青年学术讨论会论文集[C];2002年
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1 徐丽;马铃薯Y病毒复制酶基因介导的病毒抗性研究[D];山东农业大学;2010年
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4 胡芳;甜柿果实采后生理变化对1-MCP处理的响应机制及电学特性变化的研究[D];西北农林科技大学;2010年
5 李慧娥;中国野生华东葡萄抗白粉病株系白河-35-1转录因子基因(WRKY)表达与功能研究[D];西北农林科技大学;2010年
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7 关正君;樱桃番茄的HBsAg基因转化及其突变体特性研究[D];西北大学;2011年
8 管延安;甜高粱遗传图谱的构建及能源相关性状的QTL定位[D];山东农业大学;2011年
9 孙全喜;超长链多不饱和脂肪酸合成相关酶基因的克隆与鉴定及其在作物中的异源合成[D];山东农业大学;2011年
10 龙茹;湖北大老岭落叶阔叶林群落结构和植物性系统多样性研究[D];北京林业大学;2011年
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1 兰楠;利用天南星科凝集素构建内生工程真菌及其抗虫防病效果研究[D];华中农业大学;2010年
2 张帆;dsRNA介导的番木瓜环斑病毒(PRSV)的抗病性研究[D];华中农业大学;2010年
3 魏礼玲;MYB转录因子家族相关EST干涉载体构建及遗传转化的研究[D];华中农业大学;2010年
4 姜珍;小麦根渍水形成通气组织过程中细胞壁降解与Ca~(2+)相关研究[D];华中农业大学;2010年
5 姚秋林;水稻根特异表达启动子的克隆及功能分析[D];华中农业大学;2010年
6 张晓黎;番茄耐贮藏基因标记开发及辅助自交系选育[D];华中农业大学;2010年
7 朱莹;分析耐盐基因与启动子功能的CRE/loxP重组激活系统的构建与检验[D];哈尔滨师范大学;2010年
8 刘无双;拟南芥种子特异表达基因启动子分析[D];山东农业大学;2010年
9 王妍;酸枣和西吕枣高频率不定梢诱导及酸枣遗传转化的研究[D];山东农业大学;2010年
10 曲益涛;栝楼性别转化的RAPD-SCAR标记研究[D];安徽农业大学;2010年
【同被引文献】
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1 李莉;侯丽霞;施木田;吕鑫;何启伟;;番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建[J];山东农业科学;2009年01期
2 高艳梅;翟金玲;徐远峰;黄惜;;抗PRSV转基因番木瓜研究进展[J];安徽农学通报(上半月刊);2009年03期
3 郑阳霞;李焕秀;严泽生;;RACE技术及其在植物基因研究中的应用[J];安徽农业科学;2008年07期
4 黄江华;黄嘉薇;张建军;彭仁;;番木瓜环斑病毒研究进展[J];安徽农业科学;2008年08期
5 陈修斌;黄瓜种子干热处理对生长发育及产量影响[J];北方园艺;2002年02期
6 乔小燕;马春雷;陈亮;;茶树黄酮合成酶Ⅱ基因全长cDNA序列的克隆和实时荧光定量PCR检测[J];茶叶科学;2009年05期
7 朱睿,张开立,邹向阳;RNA干扰(RNAi)技术及其在功能基因组学研究中的应用[J];大连医科大学学报;2003年02期
8 陈素梅;朱喜荣;陈发棣;罗火林;吕国胜;房伟民;章镇;;不同花色菊花品种花色素结构基因的表达特性[J];西北植物学报;2010年03期
9 唐克轩,开国银,张磊,潘征,赵凌侠,孙小芬,郑金贵;RACE的研究及其在植物基因克隆上的应用[J];复旦学报(自然科学版);2002年06期
10 肖艳;黄建昌;;番木瓜环斑型花叶病毒(PRSV)的为害特征及分子生物学[J];福建果树;2006年03期
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1 徐娟;几个柑桔产区果实色泽评价及红肉脐橙(Citrus sinensis L.cv.Cara cara)果肉呈色机理初探[D];华中农业大学;2002年
2 陶能国;甜橙(Citrus sinensis Osbeck)红肉突变体类胡萝卜素合成相关基因的克隆与特性分析[D];华中农业大学;2006年
3 卢秉国;龙眼子叶胚发育相关的若干基因克隆及序列分析[D];福建农林大学;2009年
4 申艳红;番木瓜若干果实成熟相关基因克隆及遗传转化的研究[D];福建农林大学;2009年
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1 张帆;dsRNA介导的番木瓜环斑病毒(PRSV)的抗病性研究[D];华中农业大学;2010年
2 杨成德;农杆菌介导的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因转化黄瓜的方法研究[D];甘肃农业大学;2001年
3 周焕斌;Bt基因转化花椰菜的研究[D];华中农业大学;2003年
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5 张国广;农杆菌介导的Chi和Glu基因转化黄瓜的研究[D];华中农业大学;2004年
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7 李建欣;黄瓜组织培养与农杆菌介导的遗传转化体系研究[D];河南农业大学;2006年
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10 王云梅;橄榄叶黄酮合成相关基因cDNA的克隆[D];福建农林大学;2009年
【二级引证文献】
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1 何炎森;多花水仙花色相关基因的分离及功能分析[D];福建农林大学;2013年
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1 王柬人;西双版纳黄瓜β-胡萝卜素生物合成相关基因的克隆及表达分析[D];中国农业科学院;2012年
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【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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10 刘建越;邓欣;康林;余道坚;高必达;陈冬美;;SYBR-Green实时荧光PCR检测转基因番木瓜[J];湖南农业大学学报(自然科学版);2006年04期
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1 郭金超;转基因植物及产品核酸检测新技术研究[D];上海交通大学;2011年
2 王树昌;PRSV ihpRNA干扰载体的构建及转化番木瓜的研究[D];海南大学;2014年
3 杨国峰;PRSV编码基因同源dsRNA的原核表达及其抗番木瓜环斑病毒的研究[D];海南大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 袁欣捷;番木瓜环斑病毒CP基因IR表达载体的转化及抗病性研究[D];华中农业大学;2011年
2 胡恒;番木瓜环斑病毒(PRSV)ci和nib反向重复结构表达载体的转化研究[D];华中农业大学;2011年
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