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感染萧氏松茎象绿僵菌菌株筛选及其致病机理研究

童应华  
【摘要】: 萧氏松茎象是一种危险性的松树新害虫,其危害已成为林业生产的重要问题,而绿僵菌是生物防治的主要病原真菌之一,本论文筛选出了对萧氏松茎象致病力较强的绿僵菌Ma1291-2和MaWP-01菌株,系统研究了其生物学特性、致病机理及萧氏松茎象对绿僵菌侵染的体液免疫反应,并开展了林间生物防治试验,为该害虫的生物防治奠定理论和应用基础。 1.应用10株绿僵菌菌株分别对萧氏松茎象幼虫进行致病力测定,结果表明,以浓度为(1.5±0.5)×10~6孢子·mL~(-1)的孢子悬液喷菌,7d后校正死亡率最高为91.90%,最低为15.28%,僵虫率最高为91.32%,最低为24.80%,LT_(50)为5.39-10.12d,单头虫体平均产孢量为10~6-10~7孢子·头~(-1)。其中,Ma1291-2、MaWP-01和Ma1775菌株对萧氏松茎象幼虫致病力较强,僵虫率分别为89.56%,91.32%和88.12%,LT_(50)分别为5.49d,5.72d和5.53d,且都具有较高的僵虫虫体含孢量。通过时间—剂量—死亡率模型参数估计发现,绿僵菌Ma1291-2和MaWP-01菌株对萧氏松茎象幼虫的致死效应较强的时间分别在第8d和第9d,处理的孢子浓度越高,其死亡高峰期越早。 2.利用12株金龟子绿僵菌菌株分别对萧氏松茎象成虫进行致病力测定,并选择致病力较强的菌株进行林间感染试验,结果表明:Ma1291-2菌株对萧氏松茎象的致病力最强,其次是MaWP-01菌株。以浓度(1.5±0.5)×108~孢子·mL~(-1)接菌,30d后,Ma1291-2菌株处理其校正死亡率、僵虫率和僵虫虫体含孢量分别为70.59%、70.81%和(1.90±0.34)×10~8孢子·头~(-1),致死速度最快,LT_(50)为13.89d;MaWP-01菌株处理其校正死亡率和僵虫率分别为70.02%和69.79%,LT_(50)为15.98d。通过时间—剂量—死亡率模型参数估计发现,绿僵菌Ma1291-2菌株对萧氏松茎象成虫的致死效应较强的时间在16-18d,处理的孢子浓度越高,其死亡高峰期越早。两菌株林间感染试验,萧氏松茎象校正死亡率分别为(57.85±1.19)%和(44.35±2.91)%。可见,Ma1291-2和MaWP-01菌株对萧氏松茎象幼虫和成虫均有较强的致病力,有较大的开发利用价值。 3.5种常用培养基中,Ma1291-2和MaWP-01菌株在PPDA培养基上的生长最快、产孢量最高。以葡萄糖为碳源,蛋白胨或酵母浸膏为氮源两菌株的产孢量较高;Ma1291-2菌株孢子萌发最适宜的碳源是葡萄糖,MaWP-01菌株孢子萌发最适宜的碳源是葡萄糖和可溶性淀粉。两菌株的孢子萌发较好的氮源是蛋白胨和牛肉膏。在温度25℃-28℃范围内,两菌株产孢和孢子萌发率都最好。在相对湿度90%以上,两菌株的孢子都有较高的萌发率。光照对两株菌株的产孢和萌发都较大的抑制作用。 4.利用扫描电镜对绿僵菌Ma1291-2菌株侵染萧氏松茎象成虫的部位和侵过程进行研究,结果表明,该虫主要侵染的主要部位是腹部。接菌后第2d,孢子已开始萌发,第3d,成功附着的孢子定向生长产生芽管,有的芽管末端膨大,侵染过程中未发现有附着胞产生;第4-5d,孢子定向生长的同时产生菌丝;接菌后第8d,刚死亡的虫体体表出现新的菌丝及分生孢子:接菌后第9-10d,未保湿培养的致虫体布满菌丝,并产生大量分生孢子,为再侵染提供了条件。 5.探讨萧氏松茎象成虫血淋巴细胞对绿僵菌Ma1291-2菌株侵染的免疫反应,结果表明:绿僵菌的侵染诱导了其血细胞的浓度和行为的强烈免疫反应。在侵染过程中,萧氏松茎象的血淋巴细胞出现数量增多、聚集形成结节、包囊和吞食等现象,最后血细胞黑化并受破坏而裂解。接菌后5-8d,总血细胞浓度发生先升高后下降的强烈波动变化,第7d达到最高峰,其浓度为(4.71±0.02)×10~4细胞·uL~(-1)。萧氏松茎象成虫的正常血淋巴中,浆血细胞、粒血细胞、珠血细胞、类绛血细胞和原血细胞分别占总血细胞的数量比例为(34.46±0.16)%、(17.28±0.16)%、(8.54±0.40)%、(5.01±0.32)%和(4.90±0.05)%,但浆血细胞、粒血细胞和珠血细胞浓度都在接菌后6-10d发生急速上升后下降的波动变化,而原血细胞浓度在接菌后第6d极显著下降,类绛血细胞浓度波动变化较小。 6.萧氏松茎象幼虫和成虫血细胞裂解液中酚氧化酶活性都极显著高于血浆,分别是血浆中的2.04和1.91倍;幼虫血细胞裂解液中酚氧化酶活性最高,是成虫的1.52倍。经不同致病力菌株的菌丝裂解液激活后,幼虫和成虫血淋巴中的酚氧化酶活性都明显增强,但随着菌株致病力的增强,其对酚氧化酶原的激活作用减弱。无致病力Ma20菌株的菌丝裂解液激活后,其酚氧化酶活性最强。在侵染过程中,幼虫和成虫血淋巴中的酚氧化酶活性分别在接菌后的3-4d和8-10d最强。 7.绿僵菌油剂不仅孢子萌发率较稳定,低湿环境下萌发率较高,对高温适应性较强,而且有利于孢子吸附昆虫体表,增强其对害虫的致病力。经室内培养48h后Ma1291-2和MaWP-01菌株的分生孢子在油剂中(食用调和油V:柴油V=3:7)的萌发率达80%以上,应用该两菌株的油剂进行超低容量喷菌林间感染和防治试验,结果表明:感染试验中,2种油剂处理,萧氏松茎象死亡率都极显著高于对照;Ma1291-2和MaWP-01菌株油剂防治后1a,萧氏松茎象虫口密度都极显著低于对照,防治效果分别为(46.71±1.28)%和(37.57±1.26)%,防治后2a,虫口密度仍然显著低于对照,防治效果分别为(45.47±1.70)%和(36.69±0.90)%。说明该2株菌株的油剂对萧氏松茎象有一定的控制效果,且Ma1291-2菌株在该虫生物防治中更有应用价值。 8.鉴于萧氏松茎象成虫有昼夜上下树补充营养的习性,利用绿僵菌Ma1291-2菌株无纺布菌条进行感染和林间防治试验,结果表明:感染试验中,萧氏松茎象校正死亡率和僵虫率分别为64.25%和62.25%,LT_(50)为14.43 d;林间防治试验中,2个试验区效果分别达(53.80±1.74)%和(51.54±1.35)%。林间无纺布菌条上的含孢量15d前为10~7-10~8孢子·cm~(-2),以后急速下降,30d后为10~3孢子·cm~(-2),但其孢子萌发率变化较小,30d内均有80%以上。 9.选择7种常用化学杀虫剂与Ma1291-2和MaWP-01菌株的孢子复配培养,结果表明,不同化学杀虫剂对两株菌株的孢子萌发都有显著的抑制作用,农药浓度越大,其对两菌株的孢子萌发的抑制力越强,同种农药同一浓度24h的抑制率比48h的高,说明该两菌株的孢子对化学农药较敏感,其中有机磷农药辛硫磷对两菌株的孢子萌发抑制作用都较强。


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