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鸭病毒性肝炎VFY弱毒疫苗株的筛选和免疫效果的研究

杲同玲  
【摘要】: 鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起的雏鸭的一种高度致死性传染病,该病的主要特点是发病急、传播快、病程短和死亡率高。本病可由三种不同血清型的病毒引起,即I型,II型和III型DHV。我国流行的主要是I型DHV。我国于1963年首次报道该病,在我国的大部分地区均有该病的多次爆发,病情严重,波及范围广,损失巨大,对我国的养鸭业造成严重的威胁。随着养鸭业的迅速发展,该病的发病率一直比较高。所以,在发病前对该病进行及时的预防成为控制本病的主要措施。但是近年来,发生了使用I型DVH弱毒疫苗或高免卵黄抗体进行预防和治疗无效的现象,怀疑出现了I型DHV变异株或新型鸭肝炎。 为了有效的预防DVH的爆发,需要研制出与I型DHV变异株或新型鸭肝炎相对应的疫苗来预防该病的发生。本课题针对本实验室分离鉴定保存的I型DHV变异株(VFY株)进行筛选和免疫效果的研究。 1.将I型DHV变异株(VFY株)在SPF鸡胚上传代致弱,通过测定不同代次病毒混合液的病毒含量和计算对雏鸭的免疫攻毒保护试验的半数保护量(PD_(50))进行免疫效果比较,来进行DVH变异株(VFY株)最佳代次的筛选,通过筛选确定了71代(VFY-71)为最佳免疫代次。根据结果选择VFY-71作为疫苗的弱毒株进行免疫效果研究,制备了效检用强毒(Z1),并测定其LD_(50)为2-4.63/0.5mL。 2.通过对弱毒株VFY-71的纯净度检验说明VFY-71具有无菌和单一性;通过与等量特异性抗血清中和接种鸡胚,8d后鸡胚全部存活,和标准株疫苗分别与变异株1(GY)强毒和变异株2(GZ)强毒进行交叉攻毒保护试验说明弱毒株VFY-71具有特异性;通过将VFY-71弱毒原液经皮下、腿部肌肉、口服、滴鼻和点眼五个途径进行免疫,免疫雏麻鸭全部健活,而对照组用强毒(Z1)经上述途径分别注射同样只数的雏麻鸭,各组雏麻鸭有不同程度的死亡,以及VFY-71在1日龄雏麻鸭体内连续传5代不出现毒力返强现象,说明弱毒株VFY-71是安全的。将VFY-71弱毒100倍(5.2×10~4ELD_(50)/0.5mL)稀释,经腿部肌肉、皮下、口服、滴鼻、点眼五种免疫途径注射1日龄雏麻鸭,测定了VFY-71在相同免疫剂量的条件下最佳免疫途径为腿部肌肉注射;在最佳免疫途径条件下,将VFY-71弱毒稀释成10倍,100倍、150倍、200倍、300倍、400倍、500倍、10~3倍、104倍、105倍、106倍后分别免疫1日龄雏麻鸭,测得推荐免疫剂量范围为:5.2×10~4ELD_(50)/0.5mL~5.2×10~3ELD_(50)/0.5mL ,最佳免疫剂量为3.5×10~4ELD_(50)/0.5mL。 3.建立了间接ELISA法并用此法检测鸭肝炎病毒抗体滴度。病毒抗原经反复冻融离心后氯仿处理,再经Sephadex G-200分子筛层析提纯获得包被抗原,病毒蛋白含量为9.710mg/mL。用VFY-71弱毒按所设定的免疫程序免疫健康成年公番鸭,获得琼扩效价为1:16的阳性血清,同时采集健康番鸭的血清作为阴性血清,并制备了酶标二抗。抗原的包被量为10μg/mL,酶标二抗稀释800倍,血清稀释25倍,临界值为0.345,以能产生阳性反应的血清最高稀释度为该血清的终点抗体滴度。 4.将VFY-71弱毒稀释成150倍(3.5×10~4ELD_(50)/0.5mL)经腿部肌肉注射1日龄雏麻鸭,采血分离血清,用建立的间接ELISA法测定抗体效价,免疫雏麻鸭在第5d时抗体水平达到高峰,平均抗体效价为1:392。然后呈下降趋势,到40日龄时抗体效价降到最低,为1:70。将VFY-71弱毒经腿部肌肉和皮下免疫1日龄雏麻鸭,于免疫后第3d、第5d和第7d以效检强毒(Z1)进行攻击,由结果可知,两种免疫途径均是在免疫后第5d保护率最高。说明动物的攻毒保护试验与间接ELISA测得的抗体效价结果一致。VFY-71弱毒保存于-20℃,每隔三个月抽检1次,免疫1日龄雏麻鸭,于5日龄用效检用强毒(Z1)进行攻毒,保存6个月的VFY-71弱毒能够全部保护,保存9个月和12个月的保护率分别为90%和75%。


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