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《福建农林大学》 2009年
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根癌农杆菌介导ACS反义基因转化文心兰的研究

金苹  
【摘要】: 文心兰(Oncidium spp.)为兰科文心兰属植物,是热带气生兰,因其花形独特、花姿优美、花色亮丽,而倍受人们的喜爱,市场需求量正迅速增长。本研究以“小樱桃”文心兰试管苗的叶片和根切段为材料诱导原球茎,建立文心兰高效再生系统和受体系统,并采用根癌农杆菌介导法对文心兰原球茎进行ACS反义基因遗传转化的研究。主要研究结果如下: 1.文心兰高效再生系统的建立。以文心兰试管苗的叶片和根切段为材料,研究了文心兰再生系统建立的有效途径。试验结果表明,文心兰叶片在1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培养基上,原球茎诱导率达72.6%,优于根切段在此培养基上的诱导率,因此叶片适宜作为文心兰原球茎的诱导材料;以MS为基本培养基时,BA、NAA浓度分别为2.5 mg/L、0.5 mg/L或2.0 mg/L、0.5 mg/L时,原球茎增殖系数高;原球茎分化的最适培养基选择1/2 MS+6-BA 0.8 mg/L +NAA 0.2 mg/L;最佳的壮苗生根培养基为1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+苹果汁100 g/L;在文心兰炼苗移栽时宜选择水草作为移栽基质。 2.文心兰受体系统的建立及其优化。在文心兰遗传转化研究中,若采用较大颗粒的原球茎为受体易产生嵌合体,不利于后期的鉴定筛选,这就要求对原球茎的生长条件进行优化,以获得适宜遗传转化的细小、颗粒状明显的原球茎受体材料。因此,试验以文心兰试管苗的叶片诱导出的原球茎为材料,比较不同激素配比、基本培养基、pH值、糖类型和糖浓度、光照条件、抗生素对文心兰原球茎生长的影响,并对各因素进行优化,筛选最佳的受体材料生长条件,以建立适于遗传转化的受体系统。试验结果表明,最适宜建立文心兰原球茎受体系统的培养基是1/2 MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L,其最佳培养条件为30.0 g/L白糖为最佳糖源和糖浓度、pH为5.4、琼脂浓度为5.8 g/L、1 500 lx光照强度及20~25℃的培养温度。文心兰原球茎对卡那霉素敏感,25.0 mg/L卡那霉素能够有效地抑制原球茎的生长并使其致死,而50.0 mg/L卡那霉素能够有效地抑制未转化植株的生根,因此,25.0 mg/L卡那霉素和50.0 mg/L卡那霉素分别为文心兰进行遗传转化时原球茎受体系统和小苗生根培养的有效选择压浓度。 3.根癌农杆菌介导ACS反义基因导入文心兰转化体系的确立。试验结果表明,稳定转化试验条件为选择固体培养30 d的原球茎,侵染前经过切割去顶端后培养于附加0.25 mol/L甘露醇的高渗固体培养基进行前处理5 h,农杆菌菌液浓度OD600为0.4,农杆菌重悬液白糖浓度为30.0 g/L,农杆菌的侵染时间为35 min,在25℃黑暗条件下于附加2.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的1/2 MS培养基中共培养4 d,共培养培养基pH值为5.4。将上述优化条件进行了30瓶约1 200个文心兰原球茎的遗传转化,GUS瞬时表达检测,在最优转化条件下,文心兰原球茎的GUS瞬时表达率为66.25%。 4.文心兰抗性原球茎、抗性植株的筛选及转基因植株移栽。对转化ACS反义基因的原球茎进行抗性筛选及转基因植株再生研究,采用延迟筛选法先对侵染过的原球茎在1/2 MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+ Cef 50.0 mg/L培养基上进行恢复生长30 d,再逐步提高卡那霉素浓度后,置于1/2 MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L + Cef 50.0 mg/L + Km 25.0 mg/L培养基下筛选3个月,选择后的原球茎置于1/2 MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.2 mg/L分化培养基上进行分化培养,将分化的小苗转移到1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+苹果汁100 g/L + Cef 50.0 mg/L + Km 50.0 mg/L筛选壮苗生根培养基中进行生根培养。初步观察转基因植株在生物学性状上与未转基因植株无显著差异,转基因植株移栽2个月后成活。 5.文心兰抗性植株的检测。对文心兰抗性再生植株的叶片进行GUS稳定表达检测和ACS反义基因、gus基因的PCR检测。试验共获得了121株由抗性原球茎分化出的小苗,其中23株在卡那霉素抗性筛选中生根,生根的抗性植株经GUS组织化学检测和ACS、gus基因的PCR检测有9株扩增到目的条带,初步证明ACS反义基因和gus基因已整合进文心兰基因组中。 总之,本研究建立了文心兰高效再生系统;获得了淡黄色、颗粒状明显的原球茎受体材料,建立了适宜遗传转化的受体系统;首次将ACS反义基因转入文心兰并建立了稳定的遗传转化体系;摸索出了文心兰抗性原球茎的筛选方法和筛选时期;发现在不使用AS时,高浓度糖处理可以提高农杆菌转化文心兰原球茎的转化效率。这为选育花期延长的文心兰新种质,延长文心兰切花的寿命开辟了新途径,为文心兰转基因的研究提供了技术平台。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S682.31

【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前5条
1 张振华;石斛兰文心兰转CyMV-CP、ORSV-CP基因研究[D];海南大学;2011年
2 李璐;石斛兰试管开花及其分子机制研究[D];福建农林大学;2010年
3 林海清;中国水仙ACS基因克隆及遗传转化研究[D];福建农林大学;2010年
4 音建华;枇杷离体培养及其在遗传转化与种质保存中的应用[D];福建农林大学;2010年
5 林鹤延;转基因兰花培养物继代保持及文心兰ACO基因克隆与表达分析[D];福建农林大学;2012年
【参考文献】
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【共引文献】
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3 任洪艳;孙霞;郑成淑;束怀瑞;;利用cDNA-AFLP技术筛选菊花开花相关基因[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年
4 吴锦娣;安娜;刘运权;刘伟;;建兰遗传转化体系之筛选体系的建立[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年
5 陈洁敏;周玉卿;赵九洲;种楠;;AC、HY和PN对野生四季兰迁地保护繁殖的应用效果研究[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年
6 姜福星;刘凤栾;赵梁军;;植物类原球茎研究进展[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年
7 蒋姝;孟金贵;崔光芬;贾文杰;王祥宁;吴丽芳;张艺萍;;植物离体诱变技术及其在百合育种中的应用研究进展[A];中国球根花卉研究进展2011[C];2011年
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9 杨广东;李艳娥;上官晓霞;;大白菜遗传转化系统优化的研究[A];中国园艺学会第四届青年学术讨论会论文集[C];2000年
10 王亦菲;陆瑞菊;周润梅;孙月芳;刘成洪;黄剑华;;丛生芽——文心兰快速繁殖的新途径[A];植物组织培养与脱毒快繁技术——全国植物组培、脱毒快繁及工厂化生产技术学术研讨会论文集[C];2001年
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6 刘宏波;甘蓝型油菜抗病虫基因遗传转化及转基因植株抗性鉴定的研究[D];浙江大学;2010年
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8 荣立苹;东北地区野生百合种质资源及遗传多样性研究[D];沈阳农业大学;2010年
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10 张晓曼;小报春生物学特性与多倍体种质创新研究[D];河北农业大学;2011年
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1 刘红梅;农杆菌介导百子莲抗寒基因CBF1高效转化体系的建立[D];华中农业大学;2010年
2 王俊;林荫银莲花离体快繁体系的优化及其有效成分的研究[D];华中农业大学;2010年
3 魏礼玲;MYB转录因子家族相关EST干涉载体构建及遗传转化的研究[D];华中农业大学;2010年
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5 刘鑫;利用分子标记辅助选择培育和评价三种BT基因(CRY1AC、CRY1C~*和CRY2A~*)抗虫水稻[D];华中农业大学;2010年
6 罗蓓蓓;苎麻茎皮差减文库的构建及纤维发育相关基因的筛选[D];华中农业大学;2010年
7 马栋;利用SSR分子标记定位水稻短光敏雄性不育基因[D];华中农业大学;2010年
8 秦华伟;黄瓜再生体系的建立及耐热材料的筛选[D];华中农业大学;2010年
9 刘鹍;苦瓜单倍体诱导的初步研究[D];华中农业大学;2010年
10 卢小三;两个杨树无性系再生体系的建立及抗虫基因Cry1C+9C转化的初步研究[D];华中农业大学;2010年
【同被引文献】
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4 侯春霞;王永清;李俊强;邱源;袁媛;;根癌农杆菌介导的枇杷花药胚状体遗传转化中抗生素种类和浓度的研究[J];安徽农业科学;2007年16期
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10 施隆文;孟祥云;庄应强;费伟英;毛军伟;;大花蕙兰类原球茎增殖与分化影响因素的初步研究[J];北方园艺;2008年04期
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9 陈段芬;中国水仙花型、花色发育基因(NTMADS1、NtMADS3、NTPDS1和NTPZDS1)的克隆与转化[D];中国林业科学研究院;2008年
10 胡钟东;砂梨果实成熟相关基因的克隆及其RNAi载体的构建[D];南京农业大学;2007年
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2 张锐;福建野生蕉资源RAPD分析、离体培养与SOD基因克隆[D];福建农林大学;2011年
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4 王亦菲;陆瑞菊;周润梅;孙月芳;刘成洪;黄剑华;;丛生芽——文心兰快速繁殖的新途径[A];植物组织培养与脱毒快繁技术——全国植物组培、脱毒快繁及工厂化生产技术学术研讨会论文集[C];2001年
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8 范武波;凌绪柏;;大力发展海南岛文心兰产业 促进北中部新农村经济发展[A];中国热带作物学会2007年学术年会论文集[C];2007年
9 叶秀仙;陈源泉;钟淮钦;黄敏玲;;文心兰组织培养技术研究[A];2008年福建省科协第八届学术年会农业分会场论文集[C];2008年
10 欧阳彤;陈胜;汪凤珍;;文心兰组培工厂化育苗的瓶苗质量调控[A];浙江省第二届林业科技周科技与林业产业论文集[C];2005年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 雨帆 编译;文心兰[N];中国花卉报;2003年
2 记者 韩益;台湾文心兰加快大陆推广脚步[N];中国花卉报;2011年
3 王秀海;如何养护文心兰[N];中国花卉报;2003年
4 记者 王鸿飞;江苏振兴兰业 文心兰出口美国[N];中国花卉报;2005年
5 本报记者 谭川江;夏季文心兰生产注意事项[N];中国花卉报;2009年
6 本报记者 韩益;台湾文心兰欲进军祖国大陆市场[N];中国花卉报;2009年
7 特约记者 柏斌;普洱无设施种植文心兰获得成功[N];中国绿色时报;2008年
8 范南虹通讯员 许进清;文心兰、石斛兰、红掌“受宠”[N];海南日报;2008年
9 李昆沛;需求引领热带兰产业升温[N];中国花卉报;2006年
10 本报记者 姚蓉;专注迷你兰 打开大市场[N];中国花卉报;2011年
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 崔广荣;蝴蝶兰、文心兰离体培养及其化学诱变研究[D];南京农业大学;2009年
2 李杰;几种名贵洋兰转基因受体系统的建立及遗传转化[D];南京林业大学;2005年
3 侯丕勇;真菌诱导子对铁皮石斛原球茎诱导作用的研究[D];中国协和医科大学;2005年
4 王敏艳;盆栽花卉缺素症及硫高效植物千日红(Gomphrena globosa L.)的营养生理研究[D];浙江大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 金苹;根癌农杆菌介导ACS反义基因转化文心兰的研究[D];福建农林大学;2009年
2 张小燕;短距风兰快速繁殖及原球茎增重培养动力学研究[D];南昌大学;2011年
3 李江渝;文心兰工厂化育苗变异规律的研究[D];海南大学;2011年
4 魏翠华;文心兰工厂化组培育苗技术研究[D];福建农林大学;2007年
5 林鹤延;转基因兰花培养物继代保持及文心兰ACO基因克隆与表达分析[D];福建农林大学;2012年
6 彭芳;文心兰花芽形态分化及其生理生化的研究[D];广西大学;2011年
7 金有亮;内生真菌对文心兰种苗生长发育的影响[D];海南大学;2012年
8 朱志伟;超声波处理对文心兰(Oncidium)离体形态发生及其生理生化影响的研究[D];南京农业大学;2007年
9 徐小雁;文心兰AP3-like基因的克隆与表达分析研究[D];广西大学;2011年
10 甘露;拟南芥CBF3基因转化文心兰的研究[D];海南大学;2010年
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