H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA1）蛋白的表达、纯化与鉴定

【摘要】： 禽流感(AI)自出现以来,已经给世界带来了巨大的危害和灾难。高致病性禽流感(HPAI)则主要表现为高致病率和高死亡率的全身感染,其病毒亚型多为H1和H7亚型。血凝素蛋白是禽流感病毒(AIV)最重要的结构蛋白,是诱导体液免疫的主要靶抗原,并且还能诱导细胞毒性细胞作用,具有重要的研究价值。 目的和意义:通过分子生物学手段,扩增得到H5N1亚型禽流感病毒HA1基因,将基因亚克隆到原核表达载体中,筛选出阳性重组子,使之在大肠杆菌中成功表达。摸索出蛋白表达的最佳条件,然后对目的蛋白进行纯化;并对其进行生物活性鉴定,从而验证融合蛋白的活性,为后续蛋白的应用提供直接的参考依据。即为抗禽流感H5N1亚型血凝素单克隆抗体的制备以及后续快速诊断试剂盒的研制打下良好的基础。对禽流感的早期诊断和预防,具有十分重要的意义。 方法和结果: (1)根据GenBank中H5N1亚型禽流感病毒HA1的cDNA序列,结合表达载体pET-28a(+)的特点自行设计出一对引物,用PCR的方法,成功扩增出H5N1亚型禽流感病毒HA1基因,将扩增的HA1基因片段插入到pET-28a(+)质粒中,通过PCR、双酶切和重组质粒DNA核苷酸序列测定,最终成功获得了pET-28a(+)/HA1阳性重组质粒; (2)将阳性质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,诱导表达,并通过Western-blot鉴定,进一步证明所表达的蛋白即为目的蛋白,说明HA1蛋白可在原核细胞中成功表达,获得了可表达融合蛋白pET-28a(+)-HA1-BL21(DE3)大肠杆菌细胞株,使目的蛋白可以稳定、高效地表达。因所表达的蛋白带有多聚组氨酸标签(His-Tag标签),所得少量可溶性蛋白用镍柱(Ni柱)进行纯化,然后根据融合蛋白的性质,用血凝试验(HA)对其进行活性鉴定; (3)由于表达的pET-28a(+)/HA1融合蛋白多数容易形成包涵体,不能满足制备单克隆抗体所需蛋白的量,对诱导表达获得的所含融合蛋白的包涵体进行纯化,并通过对包涵体的变性、复性处理,得到大量、高纯度的融合蛋白。 结论: (1)成功扩增了H5N1亚型禽流感病毒HA1基因; (2)将扩增基因片段插入原核表达载体中,并成功构建原核表达重组质粒; (3)阳性重组质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞,诱导高效表达; (4)用亲和层析和包涵体纯化方法得到目的蛋白,经蛋白活性测定具有较高活性;蛋白纯度较高,可用于单克隆抗体的制备,为后续的诊断试剂盒的研制奠定良好的基础。