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龙眼焦腐病菌(Lasiodiplodia theobromae)转化体系的建立

叶金巧  
【摘要】: 龙眼(Phyllanthus reticulatus Pior)采后贮藏期真菌性病害主要是由于几种病原真菌的潜伏侵染造成的,其中龙眼焦腐病菌[Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griff. Maubl.]分离频率最高(46%)。为进一步研究龙眼焦腐病菌致病的分子机制,本文致力于该菌遗传转化系统的建立。 首先,为获得大量分生孢子以培养细嫩菌丝用于原生质体制备,比较了龙眼焦腐病菌在不同培养条件下产生子座的能力,结果表明燕麦和米糠培养基最适于该菌产生子座;培养基pH6.0,连续光照15d,子座产生量最大。 其次,对龙眼焦腐病菌原生质体的制备和再生条件进行了的研究,结果是新鲜的分生孢子在CM液体培养基中培养30h左右的菌丝,采用Sorbital(1M,pH 5.5~6)作为酶液稳渗剂,用组合酶:1%纤维素酶+1%溶壁酶+1%蜗牛酶+1%崩溃酶作为裂解酶,30℃裂解3~3.5h,原生质体生成量最大,其再生率也最高,达到40%。 最后,采用PEG介导转化法将pEGFP-H3质粒转化龙眼焦腐病菌原生质体,得到35个转化子,随机挑取6个转化子经PCR验证和测序结果确认均为阳性克隆,说明了我们已经初步建立了龙眼焦腐病菌的遗传转化体系。


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