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《福建农林大学》 2010年
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厚朴遗传多样性研究及指纹图谱的构建

郑志雷  
【摘要】: 厚朴(Magnolia officinalis)是特产于我国亚热带及北热带的重要药用植物,树皮入药有多种疗效,因此被过度采剥利用,致使资源遭到严重破坏,种群数量剧减。目前厚朴已属渐危种。为了更好地收集、保存和利用厚朴种质资源,为种质创新中亲本选择、杂种鉴定提供技术支撑;为了丰富厚朴遗传学理论,为厚朴育种的杂交亲本选择,资源知识产权保护,品种改良及分子标记辅助育种提供理论基础和实践依据,本研究对厚朴酚类物质的提取,优良种质的选择、厚朴种源的遗传多样性及指纹图谱的构建等方面进行了研究。 本研究首先在对福建省内厚朴资源调查的基础上,依据厚朴酚类物质含量和表型对福建省内厚朴进行了选优,并收集全国部分厚朴主产区种源;接着试图从优化厚朴基因组DNA多态性分析的RAPD和SRAP标记方法着手,并利用这些DNA标记技术来系统研究遗传背景十分复杂的厚朴种质资源,因此,对全国部分厚朴种质资源进行遗传多样性和亲缘关系进行了研究,分析了厚朴种质资源的遗传关系;开展了种质资源的分子鉴定,建立了有效鉴定厚朴种质资源的DNA指纹图谱;并且研究了福建省栽培品种的亲缘关系等,比较了两种标记扩增效果。研究结果如下: 1、按正交设计L9(34)对厚朴酚类提取技术进行研究,结果表明乙醇浓度是厚朴酚类提取测定的关键因素,超声处理时间是第二关键因素。提取最优方法为:乙醇浓度为90%,浸泡时间为50min,浸泡温度为60℃,超声时间为20min。 2、季节的变化对植物生长次生代谢物质的含量具有影响,枝皮中厚朴酚与和厚朴酚含量的在1月份达到最高,后降低再升高,到9月份又下降的趋势。总酚含量由嫩叶到老叶呈增加趋势,直到落叶前含量达到最高。同一植株中不同器官部位厚朴酚类物质含量存在一定得差异,但同一器官中厚朴酚含量与和厚朴酚含量相差不大。不同器官中酚类物质含量大小顺序依次是:根皮干皮枝皮嫩芽种子果实枝芯叶。 厚朴随着树龄的增大,厚朴枝皮和干皮中厚朴酚与和厚朴酚含量表现为升高-下降-升高的趋势。厚朴在中幼林时随着树龄增大,酚含量增多,大致在25年左右达到最大,以后呈下降趋势,百年老树有效成含量又有增高的现象。厚朴叶中酚类含量随树龄增大呈下降趋势,幼龄树叶中酚类含量较高。 3、同一群体内,胸径大小相近的厚朴植株酚类含量个体间存在着较大的变异,个体间各部位酚类含量差异显著。厚朴优良种源选择时,树高、冠幅、树皮厚、枝条数之间都呈极显著或显著的正相关;通直度、圆满度、健康度相关性不大;枝皮中酚含量与各树体性状之间都呈极显著或显著的正相关。 按特征根大于或等于1的原则提取了四个主成分,对24个种源各主成分与综合评分,24个种源中综合排名较前的为柘荣、尤溪、连城、福州。其次是武平、永泰、寿宁、清流、沙县、永安、浦城、农大、屏南、明溪、宁化、漳平,最少是泰宁、南平、顺昌、建阳、大田、建瓯、福安、光泽。 按主成分分析法中累计贡献率大于或等于85%原则提取了六个主成分,对54株优树各主成分与综合评分,优树中得分较高为11号、6号、131号、146号、16号家系,其次为123号、33号、49号、114号、2号家系综合排名较前。 4、利用正交设计L16(45),结合单因素试验设计对厚朴相关序列扩增多态性(Sequence—relatedamplifiedpolymorphism,SRAP)标记反应体系的五因素(Mg2+,dNTP,引物,Taq酶和模板DNA)进行优化试验,结果表明:各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为:dNTPs,Taq酶,模板DNA ,Mg2+,引物;筛选出各反应因素的最佳水平,建立的厚朴SRAP-PCR反应的最佳体系(25μL)为:Taq酶1.5 U,Mg2+ 1.8mmol·L-1,模板DNA100ng,dNTP 0.24mmol·L-1,引物2×0.40μmol·L-1。试验表明,该体系重复性好、稳定性强。这一优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术对厚朴进行相关研究提供了帮助。 5、建立适宜厚朴DNA的RAPD扩增体系,为厚朴分子标记和遗传图谱的构建打下基础。本实验对厚朴RAPD-PCR技术体系的影响因素(模板DNA, Taq酶, Mg2+, dNTP,引物)进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立厚朴RAPD -PCR反应的最佳体系(25μL):10×buffer2.5μl、Mg2+(25mM) 1.8μl、dNTP(10mM) 0.6μl、引物(5μM) 1.2μl、DNA聚合酶(5U/μl)0.4μl、模板DNA(80ng/μl)1.25μl、灭菌ddH2O17.25μl。确定厚朴PAPD扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性45s,38℃退火1min,72℃延伸1min,45个循环;72℃延伸10min。试验表明,该体系重复性好、稳定性强。 6、应用19对SRAP引物对28个种群的厚朴(Magnolia officinalis)共89个个体进行遗传多样性分析。结果表明:(1)厚朴的遗传多样性水平较高,在物种平上,多态位点百分率PPL=83%,有效等位基因数Ne=1.3809,Nei遗传多样性h=0.2342,Shannon多态信息指数I=0.3638;在居群水平上, PPL=23.62%,Ne=1.1581,h=0.0910,I=0.1342。物种水平遗传多样性高于种群水平;(2)居群间的遗传分化高于居群内的遗传分化,居群间遗传多样性分化系数Gst=0.6101,居群间遗传分化占总遗传变异的61.01%,居群内的遗传变异为38.99%,较小的基因流Nm=0.3195。遗传漂变成为群体遗传多样性的主导因素,并提出保护策略。 7、应用20条RAPD引物对28个种群的厚朴(Magnolia officinalis)共89个个体进行RAPD遗传多样性分析。分析结果表明:与其它植物相比厚朴具有较高的遗传多样性,在物种平上,多态位点百分率PPL=87.36%,有效等位基因数Ne=1.4552,Nei遗传多样性h=0.2681,Shannon多态信息指数I=0.4064;在居群水平上,PPL=26.94%,Ne=1.1885,h=0.1071,I=0.1569。物种水平遗传多样性同样高于种群水平;居群间遗传多样性分化系数Gst=0.6101,居群间遗传分化占总遗传变异的61.01%,居群内的遗传变异为38.99%,说明居群间的遗传分化高于居群内的遗传分化,同时印证了厚朴的交配系统是自交和异交并存同时以近交、自交为主的物种。基因流Nm较小为0.3195,遗传漂变成为群体遗传多样性的主导因素。 8、以福建省13个厚朴种源35个厚朴样品为材料,利用SRAP和RAPD引物进行群体遗传结构的分析。结果表明:19个SRAP引物和20个RAPD引物在13个居群中分别检测出219和202个多态位点,在种级水平上多态性位点百分比为73%和77.39%,省内13个厚朴居群在种级水平上的遗传多样性丰富;在居群内分别平均检测到61.4和61.6个多态性位点,多态性位点比例为20.46%和23.58%。居群间的遗传变异分别占总变异的63.25%、60.98%;遗传多样性比较表明,建阳、浦城、明溪种源遗传多样性较高,而顺昌、连城、福州森林公园厚朴遗传多样性较低,而其它居群的多样性指数都较高且比较接近;可将遗传多样性最丰富福建省浦城、明溪、建阳种源厚朴纳入优先保护体系。由两种标记分析的各居群间的遗传关系表明,13个种源除了3、4、5号种源外聚类结果有些区别外,剰下的1号和2号聚在一起,6~13号种源也都基本上聚为一类,由结果可看出1~2和6~13分别是两个遗传上更为相似的类群。在D=0.17处划分为三类,大部分种源可以具有相似的类群划分。 9、分别用SRAP和RAPD标记构建了89份厚朴种质资源的指纹图谱,用2种独立的方法(特殊的标记、不同引物提供的谱带类型组合)可以有效地鉴别厚朴种质资源,结果表明,在89个样品当中,共有12个样品具有特征谱带,可以直接通过1对SRAP引物的扩增而鉴别,Me5∕Em2、Me6∕Em2、Me1∕Em7、Me1∕Em5、Me1∕Em8这5个引物对任意两对组合形成的指纹图谱就可将全部样品鉴别。可以看出因为SRAP引物对多态性较好,所以只需简单的两对引物就可区分出所有个体,大大提高了鉴别的效率。 选取S60、S69、S91、S1412、S1422、S330这6个多态性最好的引物进行指纹图谱的构建,经反复验证最终挑选出11对引物组合可以将所样品鉴别:S60与S69、S60与S91、S60与S1412、S60与S330、S60与S1422、S69与S91、S69与S1412、S69与S1422、S91与S1412、S1412与S1422、S1412与S330。构建了可以相互区别的RAPD-DNA指纹图谱。 10、分析了来自国内外的89个厚朴种质资源的遗传多样性, 19对多态性较好的组合扩增得到了249个多态性标记;结果显示,SRAP标记中有效等位基因数(ne),Nei’指数(h),香农信息指数(I)3个指标分别为1.3881、0.2367、0.3656。20条RAPD引物获得了228条多态性标记,得到的ne、h、I,3个指标分别为1.4368、0.2575、0.3912。显示了89个个体之间的较大的遗传差异。聚类分析表明资源都可以被分为差异明显的3大类,最大的第三类又可分为明显的两个亚类。结合SRAP标记和RAPD标记特点,既能从全基因组又能有重点的从功能基因组分析育种材料的遗传多样性,对于中长期的育种目标有较大的意义。 11、为了更好地利用SRAP和RAPD两种标记,对两种标记的扩增结果进行了比较,分析结果表明:2种分子标记方法的多态性比率分别达到了83%和87.36%,均说明厚朴具有较高的遗传多样性。从扩增的总带数、平均扩增条带数、平均多态条带数上看,SRAP标记均稍高于RAPD标记;但多态位点百分率、种间遗传多样性和种内遗传多样性却是RAPD高于SRAP标记,但是两者检测的遗传多样性还是具有还大的相似性,两者的分化系数都为60%左右存在种源间,39%左右存在种源内,检测效果相似。从遗传距离分析看,RAPD标记的遗传距离的范围比SRAP标记广。因此,相对而言,RAPD标记比SRAP标记反映了更多的遗传信息,检测到种质间较高的遗传差异。这也许是因为RAPD标记是分布在整个基因组的标记,揭示的是整个基因组的多样性,而SRAP标记目标扩增区域是开放读码框(ORF)。
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