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《福建农林大学》 2010年
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香蕉枯萎病菌GFP标记和β-葡萄糖甘酶基因克隆

李燕丹  
【摘要】: 由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense, Foc)引起的香蕉枯萎病是香蕉的毁灭性病害,香蕉的生产带来严重威胁。目前,国内香蕉生产尚无有效、稳定的控制措施。深入研究香蕉枯萎病菌的致病特性和病菌的生理学、遗传学特性,对进一步研究香蕉枯萎病的发生与流行规律、研究有效的控制方法均有一定的理论意义和应用价值。 本研究将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, gfp)基因转化入香蕉枯萎病菌,研究转化后菌株的生物学特性以及在香蕉植株体内的侵染特性,为进一步研究香蕉枯萎病菌致病机理和生防提供理论基础;同时克隆出香蕉枯萎病菌的β-葡萄糖甘酶基因,为研究此基因功能奠定基础。主要研究结果如下: 1.香蕉枯萎病株采自福建省漳州,经单孢分离、致病性测定与分子鉴定,获得21个尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种。 2.建立香蕉枯萎病菌的PEG介导原生质体法遗传转化系统,香蕉枯萎病菌的原生质体的制备是整个转化中最关键的一步,影响原生质体制备因素很多主要包括合适的酶液、菌丝的菌龄、制备原生质体的溶菌温度和溶菌时间。本文转化方法采用的是0.8 mol·L-1的NaCl溶解的崩溃酶(Drislase)和溶壁酶(Lysing Enzyme);菌龄10-14 h的新鲜菌丝;28℃,70r·min-1消化酶解2-3 h。 3.对尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种Foc-3076菌株进行gfp标记。标记后菌株的菌丝、分生孢子、厚垣孢子的形态与亲本菌株形态基本相同,且在紫外光下都呈现绿色荧光。PCR验证表明,目的基因已转入到Foc-3076菌株。且标记后菌株较之原始菌株的抗潮霉素能力大大增加。在无选择压力条件下继代培养6代,转化子仍然保持强烈的绿色荧光。gfp基因标记前后的菌株在菌落形态、最佳pH值和菌丝生长速度基本一致,菌株致病力未有明显改变,发病率均达到90%以上。 4.利用激光共聚焦显微镜扫描观察结果表明,标记病原菌侵染香蕉是以孢子萌发或菌丝体从根部侵入植株体内,并沿着寄主细胞间隙扩展与蔓延,经植株的维管束组织向上生长至植株的假茎顶部。 5.通过GenBank上近缘物种β-葡萄糖甘酶基因序列设计简并引物,提取尖孢镰刀菌古巴专化型Foc-3076菌株的RNA,通过RT-PCR扩增中间序列及3'RACE-PCR从Foc-3076菌株cDNA一链中克隆得到一个1473 bp的p-葡萄糖甘酶基因序列。
【学位授予单位】:福建农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S436.68

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【引证文献】
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【同被引文献】
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