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《集美大学》 2014年
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大黄鱼TLR和NF-κB途径中部分基因的克隆及免疫反应特征

范泽军  
【摘要】:病害问题已经严重制约了大黄鱼(Larimichthys crocea)养殖业的发展。大黄鱼病原复杂多变,因此深入了解其免疫识别及激活机制,对于大黄鱼病害防控、促进养殖业健康发展具有重要意义。本研究利用RT-PCR及RACE-PCR技术克隆了大黄鱼Toll样受体(TLR)家族中的TLR1、TLR2与TLR21,核因子NF-κB家族中的p65、p52、c-rel与IκB,以及白细胞介素家族的IL-11与IL-21基因的全长cDNA序列,分析了它们的分子结构;利用定量PCR技术或半定量PCR技术,研究了它们在大黄鱼不同组织的表达谱,解析了病原或病原相关分子模式(PAMPs)刺激后,大黄鱼脾脏、肝脏、头肾以及LCK细胞系中上述基因的转录表达变化;重组表达了TLR途径中关键接头分子MyD88,并采用GST-pulldown技术研究了与MyD88相互作用的蛋白;获得了IL-1β、IL-21的原核重组表达产物。结果如下:(1)TLR家族部分基因TLR1全长3216 bp,5’UTR为39 bp,3’UTR为768 bp,ORF为2409 bp,编码802个氨基酸,包含LRR、跨膜区和TIR结构域。TLR1基因在广泛分布于多种组织,其中在血液、心脏、脾脏和肾脏等器官中表达量较高,在皮肤、肠和胃等消化器官中表达较低;弧菌、LPS和poly I:C刺激均可诱导TLR1基因在大黄鱼肝脏、脾脏和头肾中表达量显著上调(p0.01);在LCK细胞系中,LPS、PGN和Flagellin刺激可以诱导TLR1基因表达显著上调(p0.01),但是poly I:C刺激后,TLR1表达未见显著变化。TLR2基因全长2802 bp,5’UTR为135 bp,3’UTR为189 bp,ORF为2478 bp,编码816个氨基酸,包含LRR、跨膜区和TIR结构域。TLR2基因在血液、心脏、肾脏、肝脏和脾脏等器官中表达量较高,而在脑、皮肤和鳃等器官中表达量较低。弧菌、LPS和poly I:C刺激均可诱导TLR2基因在大黄鱼肝脏和头肾中表达量的显著上调(p0.01);LPS、PGN和Flagellin刺激的LCK细胞系中,TLR2基因表达也显著上调(p0.01),但是poly I:C的刺激后,TLR2的表达量未发生显著变化。TLR21全长3240 bp,5’UTR为97 bp,3’UTR为334 bp,ORF为2909 bp,编码937个氨基酸,包含LRR、跨膜区和TIR结构域。在脾脏、头肾、肝脏和胃中表达量较高,在脑组织中表达量最低;免疫刺激均可诱导TLR21基因在肝脏、脾脏和头肾组织及LCK细胞系中表达量显著增加(p0.01)。(2)NF-κB家族中部分基因p65全长2974 bp,5’UTR为27 bp,3’UTR为1051 bp,ORF为1896 bp,编码631个氨基酸,有RHD和IPT两个保守结构域。p65基因在大黄鱼肠、脾脏、胃和鳃中表达量较高,在皮肤组织中表达量最低;免疫刺激均可诱导p65基因在大黄鱼肝脏、脾脏和头肾组织中及LCK细胞系表达量均显著上调(p0.01)。p52全长4083 bp,5’UTR为128 bp,3’UTR为1261 bp,ORF为2694 bp,编码898个氨基酸,包含1个Rel基因家族同源结构域(RHD),1个IPT结构域,6个ANK结构域和1个DEATH结构域。P52基因广泛表达于大黄鱼各组织,在胃、头肾、肠和鳃中表达量较高,在皮肤和肝脏组织中表达量最低;免疫刺激均可诱导大黄鱼肝脏、脾脏和头肾组织及LCK细胞系中p52基因的显著上调(p0.01)。c-rel全长3465 bp,5’UTR为77 bp,3’UTR为1454 bp,ORF为2694 bp,编码644个氨基酸,包含1个RHD和1个IPT结构域。c-rel基因广泛分布于大黄鱼各组织,在肠、鳃、心脏和脾脏中有相对较高的表达量,在皮肤、血液中表达量较低;免疫刺激均可诱导大黄鱼肝脏、脾脏和头肾组织及LCK细胞系中c-rel基因表达量显著上调(p0.01)。IκB全长1407 bp,5’UTR为65 bp,3’UTR为415 bp,ORF为927 bp,编码309个氨基酸,包含5个ANK结构域。IκB基因广泛分布于大黄鱼多种组织,在肠、皮肤、肝脏和肾脏中表达量较高,而在鳃和头肾组织中表达量较低;免疫刺激均可诱导肝脏、脾脏和头肾组织及LCK细胞系中IκB基因表达显著增加(p0.01)。(3)白细胞介素家族中部分基因IL-11全长1106 bp,3’UTR为503 bp,ORF为603 bp,编码200个氨基酸,包含属于IL-11基因家族的结构域。IL-11基因在大黄鱼皮肤、鳃、脑、脾脏和心脏组织中表达量较高,在头肾和肌肉组织中表达量较低;多种免疫刺激均可诱导大黄鱼肝脏、脾脏和头肾组织及LCK细胞系中IL-11表达量显著上调(p0.01)。IL-21全长880 bp,5’UTR为66 bp,3’UTR为385 bp,ORF为429 bp,编码142个氨基酸,含有属于IL-15基因家族的结构域。在大黄鱼在皮肤、鳃、肠、心脏和肾脏组织中表达量较高,在脑和肝脏组织中表达量较低;多种免疫刺激均可诱导肝脏、脾脏和头肾组织及LCK细胞系中IL-21基因表达量显著增加(p0.01)。(4)体外重组表达了TLR途径中的关键衔接蛋白MyD88,通过GSTpulldown技术获得了与MyD88相互作用的蛋白质,并进行了质谱鉴定,发现其可能通过直接与胞浆动力蛋白直接结合存在及发挥信号传递作用。(5)获得并纯化了IL-1β、IL-21的体外重组表达产物,其中,IL-1β的重组表达产物主要存在于包涵体中,但是获得了IL-21的可溶性表达产物。
【学位授予单位】:集美大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S917.4

【参考文献】
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