哈维氏弧菌运动相关基因功能研究

【摘要】： 弧菌病(Vibriosis)是一种全球范围内发生的细菌性疾病。其中哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是一种水产养殖业中非常重要的致病菌,严重威胁到水产养殖动物的健康,给海水鱼类、虾类及其他养殖对象造成巨大经济损失。因此,有关哈维氏弧菌致病机理的研究在国内外受到高度重视。现有研究发现哈维氏弧菌致病机理与胞外产物、溶血素等均相关,但有关其运动性及运动在细菌感染早期的作用尚未见报道。鉴于运动在细菌致病早期的重要作用,本研究以哈维氏弧菌为研究对象,寻找运动相关基因,试图揭示运动相关基因的功能,初步了解运动性与致病性之间的相互联系,以期对哈维氏弧菌乃至其它弧菌致病机制和防治研究提供一定的理论依据。 本研究将从Escherichia coli Sm10(pLOFKm)中携带的转座子mini-Tn10的自杀性质粒pLOFKm引入受体菌哈维氏弧菌TS-628菌株中,构建突变株库。我们从大约3000个转座突变株中筛选到3株运动缺陷型菌株。避开转座子内部酶切位点选用XbaI酶切突变株的基因组DNA,在连接酶的作用下使基因组DNA的酶切片段环化,以这些环化的片段为模板,根据转座子序列设计引物进行反向PCR,将反向PCR产物克隆到T载体测序,获得转座子侧翼未知基因的部分序列,根据获得的序列在基因库中寻找同源基因,结果发现这465bp的侧翼序列表现出与哈维氏弧菌ATCC BAA-1116菌株基因组3612978至3613443序列具有很高的同源性(96.9%),该序列在哈维氏弧菌ATCC BAA-1116菌株中为一个未知功能的蛋白,此外,该序列还与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)RIMD 2210633菌株基因组中的pgk (磷酸甘油酸激酶)基因具有第二高(91.8%)的同源性。突变株H2反向PCR产物片段长约950bp,其中356bp为获得的插入位点侧翼的未知基因序列,该序列经过同源性比较发现与哈维氏弧菌ATCC BAA-1116菌株基因组3203663至3204019序列的同源性最高(94.6%),与溶藻弧菌(V.alginolyticus)HY9901菌株鞭毛蛋白基因flaB具有第二高的同源性(92.4%)。 最后鉴定了突变株在生长、趋化、早期黏附及生物膜形成等方面的生物学特性。结果发现,突变株H1生长参数明显不同于野生株。趋化性测定显示,3株突变株均都趋化性减弱。对野生型和3株突变型菌株早期粘附研究发现,野生型菌株粘附能力均强于3株突变株。对于生物膜形成研究说明野生型菌株形成生物膜的能力强于突变株,而在3株突变株中H2型菌株形成的生物膜的能力最弱。 总之,通过本研究寻找到哈维氏弧菌2个运动相关基因的部分序列,对这两段序列进行同源性分析及基因功能研究,结果认为这两个片段的基因功能为运动相关基因。它们的功能分别与pgk(磷酸甘油酸激酶)基因和鞭毛蛋白基因flaB相类似。