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《福建医科大学》 2011年
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姜黄素及其衍生物C086抑制人白血病细胞增殖与阻断Hsp90伴侣功能的关系

余靖  
【摘要】:Hsp90作为分子伴侣,其已确定的客户蛋白超过200个。由于它的许多客户蛋白是细胞增殖信号通路中的重要分子,与肿瘤密切相关,Hsp90已经成为抗肿瘤药物的很有前景的靶点。 姜黄素是一种黄色的多酚化合物,能够阻断多条信号通路而抑制肿瘤的持续生长、侵袭、血管生长和肿瘤转移等多种生物学行为。姜黄素调控的多个分子靶点,如Bcr/Abl、EGFR、Src、Erb-B_2、VEGF和端粒酶也是Hsp90的客户蛋白。本课题组前期研究首次报道,姜黄素抑制K562细胞增殖与下调p210~(Bcr/Abl)有关。姜黄素在使Hsp90/p23与p210~(Bcr/Abl)结合减少,引发p210~(Bcr/Abl)的快速降解的同时,Hsp70/p60~(Hop)与p210~(bcr/abl)的结合增加,这个特征与Hsp90的N端抑制剂GA很相似。提示Cur下调p210~(bcr/abl)蛋白含量是通过干扰Hsp90的分子伴侣功能实现的。 然而姜黄素生物利用度低,限制了其临床应用。人们尝试多种方法试图提高姜黄素的生物利用度。本实验室新合成了姜黄素衍生物C086。本实验试图探讨姜黄素及其衍生物C086对人白血病细胞增殖的影响及其与Hsp90分子伴侣功能的关系。 第一部分姜黄素衍生物C086对人白血病细胞增殖的抑制作用 目的:研究姜黄素衍生物C086抑制人白血病细胞增殖和诱导凋亡的作用及其机制。 方法:⑴MTT法检测C086对细胞增殖的影响;⑵瑞氏-吉姆萨染色观察C086对细胞形态的影响;⑶AO-EB染色观察C086对细胞凋亡影响;⑷免疫荧光检测细胞Bcr/Abl蛋白表达的改变;⑸分光光度法检测Caspase 3和Caspase 9的活性;⑹免疫印迹分析检测细胞Bcr/Abl, Erk_(1/2), p-Erk, Akt, p-Akt, PKC, Raf, C-myc, Src, p-Src, Bcl-2, Bax, Fas, Fasl, Caspase3, Caspase9和p53蛋白表达量;⑺联苯胺染色法检测C086对K562细胞红系分化的影响。 结果:⑴C086可抑制K562、HL-60和HL60(Bcr/Abl)细胞增殖,且活性较Cur明显增强;⑵C086可下调K562、HL-60和HL60(Bcr/Abl)细胞中p-Erk、p-Akt、Pkc、Raf、C-myc、p-Src蛋白含量;⑶C086可下调K562和HL60(Bcr/Abl)细胞中Bcr/Abl蛋白含量;⑷C086可下调K562、HL-60和HL60(Bcr/Abl)细胞中Bcl-2蛋白含量,上调Bax含量;⑸C086诱导K562细胞凋亡,增强细胞中Caspase3和Caspase9活性,上调细胞中Fas、Fasl、Caspase3、Caspase9以及p53蛋白含量;⑹C086诱导K562细胞向成熟红系细胞分化。 第二部分姜黄素及其衍生物C086对白血病细胞中Hsp90分子伴侣功能的影响目的:研究姜黄素及其衍生物C086对白血病细胞中Hsp90分子伴侣功能的影响。方法:⑴免疫印迹分析检测细胞中Hsp90、Hsp70、p23和p60~(Hop)蛋白含量的变化;⑵免疫组化检测细胞中Hsp70表达的改变;⑶Realtime PCR检测药物对细胞中HSP90和HSP70基因mRNA水平的影响;⑷免疫共沉淀检测药物对细胞中Bcr/Abl/Hsp90/Hsp70/p23/p60~(Hop)蛋白结合状态的影响;⑸荧光光谱实验研究药物与异源表达的Hsp90和NHsp90的相互作用;⑹Piper Phosphate Assay Kit检测药物对细胞中Hsp90的ATPase活性的影响。 结果:⑴Cur和C086可以上调K562、HL60和HL60(Bcr/Abl)细胞中Hsp70含量,对细胞中Hsp90、p23和p60~(HOP)含量无明显影响,作用趋势与GA一致;C086可以下调Hsp90含量;⑵C086在mRNA水平上调K562细胞中Hsp70含量,下调K562细胞中Hsp90含量;⑶Cur和C086可使K562、HL60和HL60(Bcr/Abl)细胞中与Hsp90结合的Hsp70增多,与Hsp90结合的p23减少,与Hsp90结合的p60~(HOP)不变;⑷Cur和C086可使K562和HL60(Bcr/Abl)细胞中与Bcr/Abl结合的Hsp70增多,与Bcr/Abl结合的Hsp90、p23减少,与Bcr/Abl结合的p60~(HOP)不变;⑸Cur和C086与异源表达的Hsp90和NHsp90相互作用;⑹Cur抑制Hsp90的ATPase活性。 第三部分姜黄素衍生物C086对K562细胞裸鼠异种移植瘤的作用及相关机制研究 目的:我们建立了K562细胞裸鼠异种移植瘤模型,将在体外研究的基础上继续研究姜黄素衍生物C086在体内是否也产生抗癌作用,并探索其体内作用机制。 方法:⑴皮下注射K562细胞,建立K562细胞裸鼠异种移植瘤模型;⑵将荷瘤裸鼠随机分为四组,分别是生理盐水阴性对照组、C086低剂量组(50 mg/kg)、C086中剂量组(100 mg/kg)和C086高剂量组(200 mg/kg),每组6只裸鼠;⑶观察成瘤情况,比较肿瘤体积;⑷称量离体瘤块质量、计算抑瘤率;⑸摘除眼球取血检测肝肾功能和血电解质;⑹HE染色光镜下观察肿瘤组织的形态结构;⑺免疫荧光检测肿瘤组织Bcr/Abl蛋白表达;⑻免疫印迹检测肿瘤组织中Erk_(1/2), p-Erk, C-myc, Hsp70和Hsp90的蛋白含量。 结果:⑴高剂量C086可以抑制K562细胞裸鼠异种移植瘤的生长,抑瘤率为44.2%;⑵C086对裸鼠肝肾功能以及电解质代谢没有造成不利影响;⑶C086下调K562细胞裸鼠异种移植瘤中Bcr/Abl、Erk_(1/2)、p-Erk、C-myc和Hsp90蛋白含量,上调Hsp70蛋白含量。 结论:本研究首次证明姜黄素衍生物C086抑制人白血病细胞增殖。姜黄素和C086抑制肿瘤细胞增殖的机制可能与阻断Hsp90的分子伴侣功能有关。C086也可以抑制K562裸鼠异种移植瘤的生长。
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285

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