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《福建医科大学》 2010年
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DNA电化学生物传感器检测乳腺癌转移标志基因的实验研究

许雄伟  
【摘要】:目的 1.制备并表征电化学传感器,研究电化学传感器的性能,为电化学传感器用于乳腺癌转移标志基因的检测提供科学的实验基础; 2.建立DNA电化学生物传感器用于乳腺癌转移标志基因MG检测的新方法; 3.建立DNA电化学生物传感器用于乳腺癌转移标志基因CK19检测的新方法,实现对乳腺癌转移的早期诊断。 方法 1.在-0.2 V ~ +1.6 V电位区间内,以100 mVs-1的扫速通过循环伏安法(CV)聚合15圈来制备溴百里香酚蓝聚合膜修饰电极,用交流阻抗法(EIS)对制备的电极进行表征;利用抗坏血酸(AA)、多巴胺(DA)和尿酸(UA)三种物质作为电活性模型分子,在pH 5.0 PBS溶液中,通过制备的BTB修饰电极对三种电活性模型分子的同时测定,研究制备的电化学传感器的性能。 2.以玻碳电极为基底电极,设计25个碱基长度乳腺癌转移标志基因MG单链DNA片段作为探针,通过基于偶联活化剂技术的共价键合法,将MG单链DNA序列探针固定到电极表面,利用电化学交流阻抗检测技术进行DNA杂交前后电信号的检测,并对检测的实验条件进行了优化,构建了DNA电化学生物传感器检测乳腺癌转移标志基因的新方法;应用建立的新方法对临床乳腺癌实际样本PCR扩增产物进行了初步检测,并与传统凝胶电泳方法进行对照试验研究。 3.以金电极为基底电极,设计25个碱基长度乳腺癌转移标志基因CK19基因DNA片段作为探针,通过自组装法将探针固定于电极表面,采用交流阻抗法并结合电化学活性指示剂MB对探针固定条件及探针稳定性进行考察,在此研究基础上构建了以Hoechst 33258为杂交指示剂的CK19基因电化学生物传感器。同时考察和优化了探针与配对DNA之间的杂交条件,并进行了相关的线性检测。 结果 1.抗坏血酸(AA)、多巴胺(DA)和尿酸(UA)三种电活性模型分子在聚溴百里香酚蓝修饰玻碳电极表面的电化学活性得到了大大提高。聚合膜的厚度和电解质缓冲液酸度对聚合物膜修饰玻碳电极有一定的影响。而且能解决同时测定AA,DA和UA中峰重叠问题,AA,DA和UA分别在94 mV,296 mV和438 mV出现三个分离良好的DPV峰,AA,DA和UA最低检测限分别为1.0×10?6 M,1.0×10?8 M和1.0×10?6 M。同时,溴百里香酚蓝聚合膜修饰电极还分别成功测定了维生素C注射液、多巴胺注射液、尿液实际样品中AA, DA和UA的浓度。 2.实验采用十二烷基磺酸钠(SDS)作为去除剂,能够有效去除单或双链DNA在电极表面的非特异性吸附。经考察,SDS最佳洗脱时间为3 min,探针固定最佳时间为30 min,杂交最佳的温度和时间分别为37℃和20 min,在此实验条件下,利用电化学交流阻抗检测技术测得乳腺癌转移标志基因MG在1.0×10-9 ~ 2.0×10~(-8) mol·L~(-1)的浓度范围内与电化学交流阻抗检测信号呈线性关系(r=0.9992),检测限为5×10~(-1)0 mol·L~(-1)(S/N=3);分别用凝胶电泳法和新建立电化学法对临床乳腺癌实际样本PCR扩增产物进行检测时发现,当稀释倍数至32倍时凝胶电泳法未能检测到明显荧光信号,而稀释倍数至512倍时用新建立电化学法还可观察到明显的电信号。 3.采用交流阻抗法并结合电化学活性指示剂MB对探针固定条件进行摸索时发现,在温度4°C时,固定时间20 h的情况下探针在金电极表面能形成稳定的自组装膜,探针最大固载浓度为3μmol·L~(~(-1));荧光光谱分析结果表明,Hoechst 33258是一种特异性较强的指示剂,可以特异地与CK19基因片段结合,并能有效地区分ssDNA和dsDNA;在以Hoechst 33258为杂交指示剂,电化学法检测CK19基因特异序列的实验中,55℃杂交30 min,检测信号良好。互补DNA在5.0×10~(-7) ~ 5.0×10~(-6) M浓度范围内,与检测信号成线性关系,线性方程为Ip(μA)=2.8734+0.25562C(μM),r=0.9971,检测限达到1.8×10~(-8) M。 结论 1.本实验制备的电化学传感器,通过聚BTB修饰电极对AA、DA和UA三种电活性模型分子的电催化性能的研究,表明聚BTB修饰电极具有很好的敏感性和选择性,可同时用于三种电活性模型分子及其实际样品的测定。因此溴百里香酚蓝(BTB)聚合膜修饰电极在生物化学分析中可发挥更大的作用,为电化学传感器用于乳腺癌转移标志基因的检测提供科学的实验基础。 2.本实验构建的用于乳腺癌转移标志基因MG检测的DNA电化学生物传感器,能够很好的区分乳腺癌转移标志基因MG的单、双链系列人工样品,具有快速、准确、灵敏、操作简便的优点;通过对临床实际样本PCR扩增产物的测定,与传统的凝胶电泳方法相比较,检测速度更快、灵敏度更高,为最终应用于临床乳腺癌转移的早期诊断提供科学的实验依据。 3.本实验构建了以Hoechst 33258为杂交指示剂的CK19 DNA电化学生物传感器,该传感器能很好的识别杂交溶液中的完全互补序列与单碱基突变序列,具有灵敏度高、特异性强、重现性好等优点,与实验第二部分构建的用于乳腺癌转移标志基因MG检测的DNA电化学生物传感器相结合,进而开发多通道电化学生物传感芯片,可以实现对乳腺癌转移的快速诊断,因此本实验研究具有巨大的潜在临床应用价值和深远的意义。
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R737.9

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