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《福建医科大学》 2010年
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褪黑素对小鼠胃癌抑制作用及其与CD4~+CD25~+Treg细胞和TGF-β信号通路的关系

刘卉  
【摘要】:胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发生发展机制尚不明确,提高机体对肿瘤的免疫效应是目前生命科学领域的研究热点之一。CD4~+CD25~+调节性T(Treg)细胞具有免疫无能和免疫抑制两大特征,对肿瘤发生发展有负调节作用,与胃癌预后呈负相关。前期大量研究证实褪黑素有抗肿瘤及免疫调节作用,而褪黑素与胃癌、Treg细胞三者之间直接联系的研究尚未见公开报道。本研究旨在探讨褪黑素对小鼠胃癌抑制作用及其与CD4~+CD25~+ Treg细胞和TGF-β信号通路的关系及相关机制,为胃癌寻找一条基于神经-内分泌-免疫-肿瘤网络的综合治疗模式的新思路。 1.褪黑素体内抗小鼠胃癌作用及其与CD4~+CD25~+ Treg细胞的关系 为研究褪黑素体内抗小鼠胃癌作用及其与CD4~+CD25~+调节性T细胞的关系,本部分研究建立荷胃癌小鼠模型,不同浓度褪黑素干预后,运用流式细胞术、实时荧光定量RT-PCR、免疫荧光双染色法、免疫印迹法、ELISA等方法检测CD4~+CD25~+ Treg细胞及相关因子的表达变化。结果表明褪黑素能够缩小荷胃癌小鼠的肿瘤体积,减轻肿瘤重量,达到抗肿瘤作用;褪黑素在抑制肿瘤过程中下调肿瘤组织的Treg细胞及Foxp3表达,且能使荷胃癌小鼠的胸腺、脾增加的Treg细胞数及增高表达的Foxp3蛋白恢复到正常水平,但对脾Foxp3mRNA有上调作用;褪黑素还使荷胃癌小鼠外周血清升高表达的的TGF-β1下降到正常水平。表明褪黑素抗肿瘤的途径之一是降低体内Treg细胞数。 2. CD4~+CD25~+ Treg细胞在褪黑素体外抗小鼠胃癌细胞增殖中作用 为研究褪黑素体外抗小鼠胃癌细胞增殖作用及其与CD4~+CD25~+ Treg细胞的关系,本部分建立不同浓度褪黑素干预胃癌细胞模型,并选择性加入Treg细胞或CD4~+CD25- T细胞共培养,运用细胞免疫磁珠分选、流式细胞术、荧光双标染色、CCK-8、ELISA等方法检测胃癌细胞增殖活性及细胞周期变化。结果表明褪黑素抑制胃癌细胞的增殖,呈剂量依赖性,并与细胞周期G2/M期阻滞有关;CD4~+CD25~+ Treg细胞在体外对褪黑素抑制肿瘤细胞增殖过程中未起拮抗作用。 3.褪黑素对胃癌细胞与CD4~+CD25~+ Treg细胞共培养体系相关因子的影响 为进一步研究褪黑素对细胞共培养体系影响的可能机制,本部分沿用小鼠胃癌细胞与Treg细胞或CD4~+CD25- T细胞共培养体系,褪黑素进行干预后,运用实时荧光定量RT-PCR、双荧光素酶报告基因系统、免疫组化、免疫印迹法等方法探讨褪黑素对共培养体系中相关因子Foxp3及survivin、caspase-3的影响。结果发现褪黑素在抑制胃癌细胞增殖过程中对共培养的Treg细胞的Foxp3mRNA表达有明显上调作用,并呈剂量依赖性,但褪黑素未能明显增高Foxp3启动子的转录活性。褪黑素降低胃癌细胞survivin的表达,进而激活caspase-3的活性,是褪黑素体外抑制胃癌细胞增殖的作用机制之一;而与胃癌细胞共培养的Treg细胞对胃癌细胞survivin的表达有上调作用,CD4~+CD25- T细胞则明显增敏了褪黑素对胃癌细胞的survivin及caspase-3的影响。 4. TGF-β信号通路在褪黑素体内外抑制小鼠胃癌细胞增殖中的作用 为研究TGF-β1在褪黑素抑制胃癌细胞增殖过程中的作用,本部分研究体内实验沿用第一部分动物模型,探讨褪黑素对荷胃癌小鼠胸腺、脾、肿瘤组织TGF-β1基因转录与翻译水平表达的影响;体外实验则建立不同浓度褪黑素在不同时间点干预胃癌细胞模型,利用TGF-β1细胞因子刺激、抗TGF-β1中和抗体阻断、反义核酸技术沉默TGF-β1表达等手段探讨TGF-β信号通路在褪黑素抑制胃癌细胞增殖中的作用。结果发现褪黑素在体内抑制胃癌过程中上调肿瘤组织的TGF-β1表达,且使荷胃癌小鼠胸腺TGF-β1表达明显下调,同时使脾下调的TGF-β1表达恢复到正常水平。褪黑素体外抑制胃癌细胞增殖过程中,伴有TGF-β1表达增高,呈时间依赖性。SiRNA介导的TGF-β1沉默和抗TGF-β1中和抗体联合应用彻底阻断TGF-β1通路,能显著拮抗褪黑素对胃癌细胞生长增殖的抑制,同时促使MFC细胞的G1期向S期转变,提示TGF-β1参与细胞正常生长增殖的调控,褪黑素抑制胃癌细胞增殖的途经之一是依赖TGF-β1信号通路。 综上所述,褪黑素体内外能够抑制小鼠胃癌细胞增殖,其机制包括下调体内CD4~+CD25~+ Treg细胞数及Foxp3表达和改变TGF-β信号通路。
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.2

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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王晖;褪黑素对肺缺血再灌注损伤保护作用的实验研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年
2 黄福新;褪黑素及其重要衍生物的化学发光和电致化学发光行为的研究[D];福州大学;2002年
3 徐维平;褪黑素介导类风湿关节炎的可能机制[D];安徽医科大学;2001年
4 李秀;褪黑素与中华蜜蜂行为发育关系的初步研究[D];中国农业大学;2004年
5 何毅;褪黑素修饰超氧化物歧化酶及其性质的初步研究[D];华中师范大学;2004年
6 高金锁;褪黑素提高肝癌细胞对内质网应激诱导的细胞凋亡通路的敏感性[D];安徽医科大学;2011年
7 金宛宛;寻常型白癜风患者血清及CD4~+CD25~+T细胞分泌TGF-β1水平检测[D];大连医科大学;2010年
8 侯衍飞;褪黑素及其类似物改善SHR大鼠代谢综合征的研究[D];南华大学;2011年
9 周宇;褪黑素抗脑缺血再灌注损伤作用及机制[D];福建医科大学;2003年
10 汪文生;褪黑素增强阿霉素对HepG2细胞株的增殖抑制作用及其机制研究[D];安徽医科大学;2010年
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