GPR40与β细胞脂毒性的关系及吡格列酮干预作用研究

【摘要】：游离脂肪酸(FFAs)短期干预可促进β细胞分泌胰岛素,长期干预抑制β细胞的功能。研究发现FFAs受体G蛋白偶联受体40(GPR40)能介导胰岛素分泌,在2型糖尿病的病理生理机制中起重要作用。尽管进行了许多研究,目前GPR40的生物学功能还未完全清楚。为了对GPR40有更加深入的认识,本研究探讨GPR40是否介导FFAs对胰岛β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)的短期和长期影响;是否介导FFAs对β细胞胰-十二指肠同源盒基因-1(PDX-1)和葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)表达的影响,以及是否参与吡格列酮对胰岛β细胞脂毒性的干预作用。 本研究第一部分构建稳定表达GPR40shRNA的βTC6细胞株。首先设计合成两对含GPR40shRNA的寡核苷酸模板链,连接入线性pSilencer4.1-CMV neo siRNA表达载体,并测序鉴定。脂质体法把载体转染至βTC6细胞,通过G418筛选得到稳定转染的βTC6细胞株。RT-PCR和western blot检测细胞GPR40 mRNA和蛋白的表达情况。结果显示成功构建了GPR40 shRNA重组质粒,转染重组质粒pSilencer-GPR40shRNA的βTC6细胞GPR40 mRNA和蛋白表达比对照组显著降低,建立了持续低表达GPR40的βTC6细胞株。 本研究第二部分旨在探讨GPR40是否介导FFAs和吡格列酮作用下βTC6细胞的GSIS。分别以不同浓度FFAs(0.25、0.5或1 mmol/L,油酸与棕榈酸的比例为2:1)或/和吡格列酮(0.1、1或10μmol/l)干预细胞1小时或48小时。结果显示,FFAs干预一小时,阴性对照组的GSIS显著增加,但转染GPR40shRNA的细胞GSIS未见明显增加。FFAs干预48小时后,GPR40shRNA细胞与阴性对照组GSIS均显著下降。吡格列酮与FFAs共同干预48小时,阴性对照组GSIS较FFAs干预48小时显著增加,但GPR40shRNA组未见显著变化。 本研究第三部分探讨FFAs是否通过GPR40影响βTC6细胞PDX-1和GLUT2的表达,吡格列酮对脂毒性的保护作用是否通过GPR40的介导而影响βTC6细胞PDX-1及GLUT2的表达。分别以0.5 mmol/L FFAs干预1小时或48小时,或0.5 mmol/L FFAs与10μmol/l吡格列酮共同干预细胞48小时。结果显示,FFAs干预1小时显著增加阴性对照组PDX-1和GLUT2的表达,而转染GPR40shRNA的细胞PDX-1和GLUT2的表达未见明显增加。FFAs干预48小时后,转染GPR40shRNA的细胞与阴性对照组PDX-1和GLUT2的表达均下降。吡格列酮与FFAs共同干预48小时,阴性对照组PDX-1和GLUT2的表达较FFAs干预48小时显著增加,但GPR40shRNA组未见显著变化。 综合上述结果,GPR40介导了FFAs短期作用下β细胞GSIS的增加以及PDX-1和GLUT2表达的上调,但未介导FFAs的慢性脂毒性作用。而吡格列酮对β细胞脂毒性的改善则可能部分通过GPR40的作用增加PDX-1和GLUT2的表达,从而改善GSIS。

【关键词】：游离脂肪酸 GPR40 短发夹RNA βTC6细胞 胰岛素分泌 PDX-1 吡格列酮
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R587.1
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