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《福建医科大学》 2010年
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肺炎支原体ORF6区基因的克隆与表达及应用于血清学诊断的初步研究

王惠榕  
【摘要】:肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae ,MP)是引起气管支气管炎和原发性非典型性肺炎的主要病原体,10%-30%的社区获得性肺炎是由MP引起的。鉴于MP的生长缓慢且从临床样本中进行分离培养相当困难不适用于该病原体感染的诊断,此外由于MP缺乏细胞壁,用于治疗细菌感染的青霉素和β内酰胺类药物对它无效。为了能够尽早地使用恰当的抗菌素进行治疗,用可靠而敏感的血清学检测方法对MP早期感染的临床诊断进行证实是必须的。研究表明,MP P90粘附相关蛋白具有很强的免疫原性,是MP诊断和疫苗研究的重要候选抗原分子。 本研究采用PCR方法,从肺炎支原体FH株基因组中扩增了长为1003bp的ORF6区DNA片段,用TA克隆的方法克隆该片断,并以该重组质粒为模板,扩增ORF6区基因,此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pET -32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后得重组蛋白pro2174-3176。采用SDS-PAGE和Western blot验证,在相对分子量56.8kDa处有阳性表达条带,符合预期大小;该蛋白带能与肺炎支原体阳性血清反应,具有良好的免疫原性,可以作为抗原检测肺炎支原体抗体。用电洗脱法纯化重组蛋白可获得高纯度的重组蛋白,以纯化的重组蛋白作为包被抗原,采用方阵滴定法确定抗原最佳工作浓度,按照确定的抗原最佳工作浓度包被酶标板,建立间接ELISA法检测肺炎支原体IgM抗体,并与国外2种商品化ELISA试剂盒检测结果对照,初步考核检测方法的敏感性和特异性。结果表明本研究建立的间接ELISA方法特性强、敏感度高,为试剂盒的研制与开发奠定了基础。
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R440

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【参考文献】
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