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《福建医科大学》 2011年
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正己烷对卵母细胞成熟和颗粒细胞凋亡的影响及其机制研究

刘瑾  
【摘要】:正己烷(n-Hexane)是己烷(C6H14)主要异构体之一,在生产环境中主要以气体形式经呼吸道吸收。2,5-己二酮是其主要的活性代谢产物。正己烷常用作为提取植物油与合成橡胶的溶剂,职业性接触机会较多(尤其是女工)。所以正己烷接触所引起的女(雌)性生殖毒性损害应当引起人们高度的重视。本实验研究正己烷对卵母细胞成熟与卵巢颗粒细胞凋亡的影响。以期为正己烷的卵巢毒性及其机理研究提供科学依据。同时,研究和建立HELMET这一新的DNA甲基化检测技术,为进一步开展环境化学物的生殖毒性的表观遗传毒理学研究奠定基础。 (一)正己烷对卵母细胞发育成熟的影响 目的:通过雌性ICR小鼠卵母细胞体内及体外培养实验,探讨正己烷及2,5-己二酮对卵母细胞发育成熟的影响 方法1:清洁级雌性ICR小鼠40只,21天龄,13-15g,按体重分层,随机分为4组,每组10只,染毒剂量分别为0、5.7、22.5、90.9ml/m~3正己烷,静式吸入染毒,8h/d,连续染毒7天。染毒第6天注射PMSG10IU/ml。染毒结束后,取出卵母细胞,放入培养液中培养,分别于培养后0小时及24小时,在倒置显微镜下观察小鼠卵母细胞生发泡破裂率、第一极体释放率、卵母细胞死亡率,在激光共聚焦电子显微镜下观察线粒体膜电位及卵母细胞早期凋亡情况。 方法2:成年雌性ICR小鼠40只,体重26-28g,按体重分层,随机分为4组,每组10只,染毒剂量分别为0、5.7、22.5、90.9ml/m~3,静式吸入染毒,8h/d,连续1周。染毒第5天注射PMSG10IU/ml ,48小时后腹腔注射HCG8IU/ml。染毒结束后将雌性小鼠按照2:1与雄性小鼠同笼。观察雌性小鼠阴栓出现情况,确认交配成功后,次日在倒置显微镜下计数2细胞受精卵数,第三日计数4细胞受精卵数目。 方法3:清洁级雌性ICR小鼠40只,21天龄,注射PMSG10IU/ml,48小时后将其麻醉处死,取出卵母细胞,置培养液中,染毒2,5-己二酮,剂量分别为0、20、40及60mmol/L。在倒置显微镜下观察小鼠卵母细胞第一极体释放率、生发泡破裂率、卵母细胞死亡率;在激光共聚焦电子显微镜下观察线粒体膜电位及卵母细胞早期凋亡情况。 结果: 1、生发泡破裂(GVBD)率:染毒正己烷后,0小时各染毒剂量组与对照组比较,GVBD率差别无统计学意义(P0.05),但随着染毒剂量的增加,GVBD率有所下降。24小时后,各染毒剂量组GVBD率降低,且5.7ml/m3及90.9ml/m3染毒组GVBD率与对照组比较,差别具有统计学意义(P0.01)。90.9ml/m3染毒组部分卵母细胞形态异常。染毒2,5-己二酮24小时后,各染毒剂量组GVBD率降低,与对照组比较,差别无统计学意义(P0.05)。60.0mmol/L染毒组部分卵母细胞形态异常。 2、第一极体释放率:染毒正己烷后,0小时90.9ml/m3组与对照组比较,第一极体释放率降低差异具有统计学意义(P0.01)。24小时后各染毒剂量组第一极体释放率降低,且90.9ml/m3染毒组与对照组比较,差异有统计学意义(P0.01)。90.9ml/m3染毒组部分卵母细胞第一极体形态异常。染毒2,5-己二酮24小时后,60.0mmol/L染毒组第一极体释放率降低,与对照组比较差别有统计学意义(P0.05)。60.0mmol/L染毒组部分卵母细胞第一极体形态异常。 3、卵母细胞死亡率:染毒正己烷后,0小时22.5ml/m3及90.9ml/m3染毒组与对照组比较,卵母细胞死亡率明显升高,差别有统计学意义(P0.01,P0.05)。24小时后,各染毒剂量组卵母细胞死亡率升高,且22.5ml/m3及90.9ml/m3染毒组与对照组比较,差别有统计学意义(P0.05,P0.01)。染毒2,5-己二酮24小时后,60.0mmol/L染毒剂量组卵母细胞死亡率升高,与对照组比较差别均有统计学意义(P0.05)。 4、受精卵数:2细胞、4细胞受精卵数与对照组比较,细胞受精卵数减少,差别有统计学意义(P0.01)。90.9ml/m3染毒组部分受精卵形态异常。 5、线粒体膜电位:染毒正己烷后,各剂量组罗丹明123荧光值降低,与对照组比较差别有统计学意义(P0.01)。染毒2,5-己二酮24小时后,60.0 mmol/L剂量组罗丹明123荧光值降低,与对照组比较差别有统计学意义(P0.01)。 6、卵母细胞早期凋亡:随着正己烷染毒剂量的增加,红绿荧光值比值先增加后减少。其中, 5.7 ml/m3剂量组JC-1荧光显示红色荧光与绿色荧光比值较对照组增加,差别有统计学意义(P0.05,P0.01)。但22.5 ml/m3及90.9ml/m3剂量组JC-1荧光比值大部分转为绿色荧光,红色荧光与绿色荧光比值较对照组降低,差别有统计学意义(P0.05,P0.01)。随着2,5-己二酮染毒剂量的增加,红绿荧光值逐渐减少。其中,60.0 mmol/L剂量组JC-1荧光值与对照组比较,差别有统计学意义(P0.01)。 (二)正己烷对卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其机制 目的:研究正己烷影响卵巢颗粒细胞凋亡及其可能机制,进一步探讨正己烷的卵泡生长发育毒性机制。 方法一:清洁级健康雌性ICR小鼠48只,6周龄,体重25-28g,按体重随机分为4组,每组12只,染毒剂量分别为0、5.7、22.5、90.9ml/m3正己烷,静式吸入染毒,8h/d,连续染毒7天。染毒结束后取小鼠卵巢,固定,切片,分别采用电镜及TUNEL法观察颗粒细胞凋亡; 方法二:清洁级健康雌性ICR小鼠48只,6周龄,体重25-28g,按体重随机分为4组,每组12只,染毒剂量分别为0、3.0、15.1、75.8ml/m3正己烷,静式吸入染毒。每天4小时,每周7天,连续5周。染毒结束后取小鼠卵巢,固定,切片,分别采用电镜及TUNEL法观察颗粒细胞凋亡;采用Realtime RT-PCR法检测Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9mRNA的表达;采用Western-blot法检测Fas、Bax及Bcl-2蛋白表达。 结果: 1、染毒7天实验:小鼠电镜观察卵巢颗粒细胞细胞核大小正常,核内可见较多常染色质,异染色质较少;在细胞质中可见丰富的线粒体,多呈椭圆形和棱形,结构完整,板块嵴清楚完整。TUNEL实验观察各中颗粒凋亡率与对照组比较无统计学差异(P0.05)。 2、染毒35天实验:小鼠卵巢颗粒细胞电镜观察发现随着剂量增加,染色质增多,成块状,染色质边集,细胞浆破坏较明显,大部分线粒体出现异常。TUNEL观察:15.1ml/m3、75.8ml/m3组成熟卵泡颗粒调亡率和黄体颗粒细胞调亡率显著高于对照组;15.1ml/m3组闭锁卵泡颗粒调亡率显著高于对照组(p0.01)。 3、各染毒剂量组Caspase-3,Caspase-8及Caspase-9mRNA表达量均增加,与对照组比较差异具有统计学意义(p0.01)。 4、Fas蛋白:Fas蛋白在各组卵巢组织中均有表达,但各染毒剂量组Fas蛋白表达与对照组比较差别无统计学意义(p0.05)。 5、Bax及Bcl-2蛋白:随着正己烷吸入剂量的增加,Bax蛋白的表达增加,各剂量组与对照组比较具有统计学意义(P0.05)。但是,各染毒剂量组Bcl-2蛋白表达与对照组比较差别无统计学意义(p0.05)。 (三)卵泡细胞DNA甲基化检测技术建立:HELMET 目的:建立HELMET实验技术,检测卵泡(主要是卵母细胞和颗粒细胞)DNA甲基化水平,为环境化学物生殖毒性的表观遗传学的进一步研究奠定基础。 方法:清洁级健康雌性Wistar大鼠10只, 12周龄。取卵巢组织固定,切片,HE染色观察各阶段卵泡;5-甲基胞嘧啶免疫组织化学技术观察各阶段卵泡细胞5-甲基胞嘧啶甲基化水平;HELMET技术观察卵泡细胞CCGG及GATCG序列甲基化水平。 结果: 1、成功建立HELMET技术,该方法可用于检测卵泡DNA序列甲基化。 2、卵泡细胞CCGG序列甲基化水平:从原始卵泡细胞到次级卵泡细胞核CCGG序列非甲基化荧光值大于甲基化荧光值,但成熟卵泡细胞相反,甲基化荧光值大于非甲基化荧光值。 3、卵泡细胞GATCG序列甲基化水平:从原始卵泡细胞到次级卵泡细胞核GATCG序列非甲基化荧光值大于甲基化荧光值,但成熟卵泡细胞相反,甲基化荧光值大于非甲基化荧光值。 结论: 根据以上结果,可得出如下结论: 1.正己烷可抑制小鼠卵母细胞的发育成熟,包括核成熟与质成熟。2,5-己二酮是正己烷影响卵母细胞核成熟的主要活性代谢产物。 2.卵母细胞线粒体的损伤及早期凋亡的出现,可能是正己烷抑制小鼠卵母细胞发育成熟的重要因素之一。 3.正己烷可以诱导卵巢颗粒细胞凋亡,其可能机制主要是通过激活Bcl-2/Bax家族途径,进而激活caspase家族途径。 4. HELMET实验方法可用于卵泡细胞不同序列的DNA甲基化水平的检测。 5.卵泡发育的各个阶段甲基化水平不一致,受精前成熟卵泡出现高度甲基化水平。
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R114

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【引证文献】
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9 刘长彬;奶牛活体采卵及体外受精的研究[D];石河子大学;2008年
10 郝子悦;猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活的研究[D];扬州大学;2008年
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