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《福建医科大学》 2012年
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棕榈酸对βTC6细胞PANDER表达的影响及Exendin-4的保护作用

项靖楠  
【摘要】:目的用不同浓度棕榈酸(PA)干预小鼠胰岛细胞瘤系βTC6细胞不同时长,并加用c-jun氨基末端激酶(JNK)特异性抑制剂SP600125,观察JNK信号转导通路关键蛋白JNK及其下游底物c-jun磷酸化情况,以及胰腺衍生因子(PANDER)的表达变化,探讨PA对β细胞PANDER表达的影响及JNK信号转导通路在其中的作用;建立小干扰RNA(siRNA)沉默PANDER表达,观察βTC6细胞PANDER沉默前后脂性凋亡的变化以及凋亡关键分子caspase-3的活性变化,探讨PA作用下PANDER上调对β细胞脂性凋亡的影响及可能机制;加用胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体长效激动剂Exendin-4处理细胞,观察Exendin-4对PA作用下βTC6细胞凋亡及PANDER表达的影响,以及在这一过程中JNK信号通路和caspase-3的活性变化,探讨Exendin-4拮抗β细胞脂性凋亡的可能机制,为临床新药开发提供一定的实验和理论依据。 第一部分棕榈酸对βTC6细胞PANDER表达的影响 方法(1)分别以不同浓度PA(0,0.125,0.25,0.5或1.0mmol/L)干预βTC6细胞不同时长(0,6,12,24或48h),用实时荧光RT-PCR法及Westernblot法检测PANDER mRNA及蛋白的表达变化;(2)以0.5mmol/L的PA干预βTC6细胞0,0.1,0.25,0.5,1,6,12和24h,应用Western blot法,使用能特异识别JNK、c-jun的磷酸化位点的抗体来检测JNK, c-jun的磷酸化水平,从而说明这两种蛋白的活化程度;(3)将βTC6细胞分为四组,分别为对照组、PA组(0.5mmol/L的PA干预24h)、SP600125组(25umol/L SP600125处理细胞24h)和PA+SP600125组(25umol/L SP600125预处理细胞1h,再予25umol/LSP600125+0.5mmol/L PA处理细胞24h),应用Western blot法检测PANDER、p-JNK、JNK、c-jun、p-c-jun的变化。 结果(1)PA可上调βTC6细胞PANDER表达,在mRNA水平,PA的作用高峰为0.5mmol/L,干预12h;而在蛋白水平,PA的作用高峰出现在0.5mmol/L,干预24h。(2)PA可致JNK通路活化,且有两个高峰,分别出现在PA干预6min及12h。(3)应用SP600125可有效抑制PA诱导的JNK及其下游c-jun磷酸化,且PA诱导的PANDER表达随之降低。 结论PA通过活化JNK信号转导通路上调β细胞PANDER表达。 第二部分PANDER在PA所致的βTC6细胞脂性凋亡中的作用 方法(1)根据小鼠PANDER基因(GenBank Accession Number:52793)的序列,选择6个位点,于体外设计并合成siRNA。评估转染效率后,以Lipofectamine2000作为载体进行瞬时转染。同时设置空白对照组(Blank Control,BC),阴性对照组(Negative Control,NC)以及转染试剂组暴露组(mock)。应用实时荧光PT-PCR及Western blot法检测各组PANDER mRNA及蛋白表达情况。(2)将βTC6细胞分NC组,siRNA组,NC+PA组及siRNA+PA组进行干预。PA的干预浓度和时间根据第一部分实验结果选择,为0.5mmol/L,24h。用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(terminaldexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)和Annexin V-FITC-PI双染,流式细胞术检测细胞凋亡。用Western blot法检测caspase-3蛋白水解后的两个亚单位,评估caspase3活化程度。 结果(1)应用序列Fam3b-mus-208可抑制PANDER基因表达,与NC组相比,在mRNA水平,抑制率达78%,在蛋白水平,抑制率约为60%,可用于后续实验(;2)PA干预后,NC组细胞caspase-3活化,凋亡显著增加;转染PANDERsiRNA的细胞caspase-3活化减少,细胞凋亡率有所降低。 结论PA可能通过上调PANDER表达进而活化caspase-3诱导胰岛β细胞凋亡。 第三部分Exendin-4对βTC6细胞脂性凋亡的保护作用 方法(1)以浓度逐渐升高的Exendin-4(12.5,25,50或100nmol/L)预处理βTC6细胞24h,再予相应浓度的Exendin-4联合0.5mmol/L PA共同干预βTC6细胞24h,用Western blot法检测细胞PANDER蛋白表达。(2)将βTC6细胞分对照组、Exendin-4组、PA组及Exendin-4+PA组进行干预。PA的干预浓度和时间根据第一部分实验结果选择,为0.5mmol/L,24h。Exendin-4的干预浓度根据本部分第一小节实验结果选择,为50nmol/L,预孵育细胞24h后再与0.5mmol/L PA共同干预24h。用TUNEL法和Annexin V-FITC-PI双染,流式细胞术检测细胞凋亡。用Western blot法检测细胞PANDER、p-JNK、JNK、c-jun、p-c-jun及cleaved caspase-3表达的变化。 结果(1)Exendin-4浓度依赖性降低PA诱导的βTC6细胞PANDER表达。(2)0.5mmol/L PA处理βTC6细胞24h后,p-JNK、PANDER表达增多,caspase-3活化,细胞凋亡明显增多;加用Exendin-4可一定程度抑制PA诱导的JNK活化,进而下调PANDER表达,减少caspase-3活化,拮抗脂性凋亡。 结论Exendin-4可能部分通过抑制JNK-PANDER-caspase-3通路,拮抗β细胞脂性凋亡
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R587.1

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【参考文献】
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