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《福建医科大学》 2012年
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高脂血症影响载脂蛋白E基因敲除小鼠对牙龈卟啉单胞菌的先天免疫并促进牙周病进展的研究

雷浪  
【摘要】:随着生活水平的提高,高脂血症对中老年身体健康影响逐渐增大。高脂血症对全身炎症和心血管疾病特别是动脉粥样硬化的影响受到了许多关注,但是其对牙周病的影响的研究相对较少。 载脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein E knock out,ApoE-/-)小鼠在普通饮食下即形成明显的高脂血症,既往研究显示:在脂多糖(lipopolysacchride,LPS)及多种致病菌刺激下,ApoE-/-小鼠比相同基因背景的C57BL/6J野生型(C57WT)小鼠血液中细胞因子水平升高,疾病进展加快。我们推测长时间高脂血症也可能促进牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)感染过程中细胞因子的释放,加速牙周病的进展。 在本实验中,为观测长时间高脂血症对牙周病的影响,ApoE-/-及C57WT小鼠在普通饮食条件下饲养至20wk。 首先,通过结扎小鼠双侧上颌第二磨牙,并接种P. gingivalis,建立牙周炎模型,结果发现: 1)ApoE-/-小鼠在实验过程中出现明显的高脂血症,而体重、血糖等其他身体代谢相关指标未见明显差异; 2)亚甲基蓝染色显示ApoE-/-小鼠比C57WT小鼠牙槽骨吸收更为严重; 3)牙周炎形成过程中,血液中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素(interleukin-6,IL-6)水平,ApoE-/-小鼠低于C57WT小鼠; 4)牙周炎形成过程中,ApoE-/-小鼠牙周清除P. gingivalis能力显著下降。 分析上述结果,高脂血症促进牙周病的进展,可能与其降低了机体对P.gingivalis的先天免疫反应有关。 接着,为进一步研究先天免疫反应的变化,通过腹腔注射P. gingivalis,建立腹腔炎症模型,结果发现: 1)细胞因子抗体芯片结果显示注射P. gingivalis6h后腹腔液中IL-3、TNF-α和γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)等20种细胞因子表达下调,仅巨噬细胞炎症蛋白-1-α(macrophage inflammatory protein-1-α, MIP-1-α)和瘦素(leptin)等5种细胞因子表达上调; 2) ELISA检测结果显示在2h、6h、12h和24h等多个时间点,ApoE-/-小鼠腹腔冲洗液中,IL-1β、TNF-α、IL-6和单核细胞趋化因子(monocyte chemotacticprotein-1,MCP-1)等促炎细胞因子表达下调,而抗炎细胞因子IL-10表达未受影响; 3)腹腔炎症形成过程中,ApoE-/-小鼠腹腔清除P. gingivalis的能力也下降。 腹腔炎症模型的结果进一步验证了高脂血症降低了机体对P. gingivalis的先天免疫反应,在后续实验中对其机制进行了深入研究。 在进一步实验中,分离小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages,PM),加入P. gingivalis刺激。利用小鼠表达谱基因芯片,研究高脂血症如何影响机体对P. gingivalis的先天免疫;利用real time PCR和ELISA,验证基因芯片结果的有效性;采用染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecepitation, ChIP),研究高脂血症对核因子-κB (nuclear factor κB,NF-κB) p65结合至染色质DNA动子序列的影响,结果显示: 1)在未加入P. gingivalis时,与C57WT小鼠相比,ApoE-/-小鼠PM中353个基因表达上调,465个基因下调表达;经P. gingivalis刺激后,148个基因上调,236个基因下调; 2)基因本体(gene ontology,GO)分析显示,加入P. gingivalis后,ApoE-/-相对于C57WT上调的基因在生物学过程中与nitrogen compoundmetabolic process、cell adhesion、multicellular organismal development、multicellular organismal development、 developmental maturation和anatomical structure development等7项功能相关;而下调的基因与生物学过程中与leukocyte mediated cytotoxicity、regulation of cell killing、positiveregulation of cell killing、immune system process、leukocyte homeostasis、immune effector process等35项功能相关。 3)通路注释分析(pathway analysis)显示加入P. gingivalis后,ApoE-/-小鼠与C57WT相比: a)下调基因属于Toll样受体(toll like receptor, TLR)通路、JAK-STAT、细胞因子-细胞因子受体和趋化因子信号通路等36条通路(基因富集度P 0.05) b)上调基因属于细胞外基质-受体、粘着斑和细胞粘附分子等16条通路; c)属于TLR通路的差异表达基因有Cd86、Cxcl10、Cxcl9、Ifnb1、Il12a、Il6、Irf7和Stat1等8个,均下调表达; d)属于JAK-STAT通路中Ccnd2、Csf2、Csf3、Ifnb1、Ifng、Il12a、Il15ra、Il6、Socs1和Stat1等10个基因差异表达,且下调表达; 4)real time PCR显示TNFa、IL6、IL12a和MCP1等表达水平与基因芯片基本一致; 5)ELISA显示高脂血症降低了PM分泌TNF-α、IL-6和MCP-1的水平; 6)ChIP显示高脂血症降低了NF-κB p65结合至TNF-α和IL-10启动子序列的能力。 结合上述结果,高脂血症下调了ApoE-/-小鼠TLR通路表达,影响了细胞因子分泌和杀灭细菌等生物学过程,可能与NF-κB p65结合至染色质能力下降相关。 细胞膜上TLR和髓系细胞触发受体-1(triggering receptors expressed onmyeloid cells-1,TREM-1)等受体的表达,将会直接影响TLR通路介导的先天免疫反应的强度。为进一步研究TLR通路受损的机制,最后,通过分离小鼠腹腔巨噬细胞,加入P. gingivalis刺激,分析了高脂血症对巨噬细胞膜表面受体的影响: 1) Real time PCR结果显示TLR-1、-2、-4和-6、NOD1、NOD、CD14和CD36等20余种膜受体转录水平未受高脂血症影响;TREM-1在加入P.gingivalis前后均表达下调; 2)利用流式细胞技术,验证蛋白水平表达,发现TLR-2和-4未受高脂血症影响,TREM-1表达下调; 3) Western blot结果显示高脂血症降低了巨噬细胞胞内诱导性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)水平,减少一氧化氮(nitricoxide,NO)产生,减弱了细胞内杀灭细菌的功能; 4) TREM-1具有放大TLR信号转导的作用,采用与TREM-1相同氨基酸序列的LP-17多肽预刺激RAW264.7细胞系,发现TREM-1阻断后,IL-6和TNF-α分泌减少。 综上所述,长时间高脂血症影响了机体对P. gingivalis的先天免疫反应能力,减少促炎细胞因子的释放,促进了牙周病进展;高脂血症影响TLR信号通路和JAK-STAT信号通路,降低了NF-κB p65结合至染色质启动子序列的能力,致急性期炎症反应不足;ApoE-/-小鼠先天免疫反应受损可能与TREM-1表达下降,对TLR信号通路的放大作用不足,导致急性期炎症反应能力下降有关。
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R781.4;R589.2

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