保护血管内皮细胞的食药用真菌粗提物筛选及对高糖损伤内皮的保护作用

【摘要】：第一部分高糖诱导HUVECs损伤模型的建立及食药用真菌粗提物的筛选 目的： 观察古尼虫草、花脸香菇、冬虫夏草、巴西革耳4种食药用真菌粗提物对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖活性的影响，筛选具有保护内皮细胞活性的有效菌菇。 方法： 体外原代培养HUVECs，以细胞形态及免疫细胞化学染色法鉴定内皮细胞。HUVECs分为对照组(M199正常培养液)、高糖组（40mmol/L高糖培养液）、4种食药用真菌（古尼虫草、花脸香菇、冬虫夏草和巴西革耳）粗提物干预组（每种粗提物以终浓度12.5、25、50、100ug/ml+高糖培养液），以四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖活性。 结果： 1. HUVECs于80%融合时呈单层铺路石样外观，95%以上细胞Ⅷ因子检测呈阳性。 2.高糖（40mmol/L）作用48h后HUVECs的MTT OD值显著低于正常对照组（P0.05）。与高糖组相比，古尼虫草粗提物（12.5-100ug/ml）干预后HUVECs的OD值无明显改变（P0.05）；花脸香菇及巴西革耳随着干预浓度增加（12.5-100ug/ml），各组OD值均显著降低(P0.05)，并呈剂量依赖性递减趋势；而冬虫夏草粗提物（12.5-50ug/ml）干预后， HUVECs的OD值显著增加（P0.05），并呈剂量依赖性；但在100ug/ml冬虫夏草作用下，OD值反而稍下降，但较高糖组仍有所上升，且有统计学差异（P0.05）。 结论： 本实验成功建立了高糖诱导人脐静脉内皮细胞体外损伤模型。冬虫夏草粗提物在一定剂量范围（12.5umol/L-50umol/L）内呈剂量依赖性地抑制高糖诱导内皮细胞损伤。而古尼虫草、花脸香菇、巴西革耳等粗提取物对高糖诱导的内皮细胞损伤无效。 第二部分冬虫夏草粗提物保护高糖诱导内皮细胞损伤的机制研究 目的： 糖尿病及其血管并发症严重威胁人类健康，已证实高血糖可通过多种直接或间接途径损伤内皮细胞，促进动脉粥样硬化等血管并发症的发生发展。本研究旨在探讨冬虫夏草粗提物（CSE）对高糖诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的影响及机制。 方法： 体外原代培养HUVECs，用高糖(40mmol/L)诱导建立内皮细胞损伤的体外模型。HUVECs分为对照组(M199正常培养液)、高糖组（40mmol/L高糖培养液）、冬虫夏草粗提物干预组（以终浓度12.5、25、50、100ug/ml）。以四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖活性；流式细胞术测定细胞周期分布和细胞内活性氧（ROS）含量；分光光度法检测细胞上清液中一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量；实时荧光定量RT-PCR测定实时荧光定量RT-PCR检测Nox4、eNOS、内皮素-1、E选择素及Sirt1的mRNA表达水平。 结果： 1.经高糖干预48h后HUVECs的MTT法吸光度值OD值显著下降,G0/G1期的细胞百分率明显增加，S+G2/M期的细胞百分率明显下降,且ROS水平亦增加（P均0.05）。细胞上清液中NO、SOD含量减少，MDA含量增高（P均0.05）。同时，细胞Nox4、内皮素-1、E选择素mRNA表达水平上调及eNOS、Sirt1mRNA表达水平下调（P0.05）。 2.与高糖组相比，CSE（12.5-50μg/mL）孵育48h后细胞OD值显著提高（P0.05）；G0/G1期的细胞百分率明显下降，S+G2/M期的细胞百分率明显上升,且ROS水平降低（P均0.05）；细胞上清液中NO、SOD含量升高，MDA含量降低（P均0.05）。同时与高糖组相比，细胞Nox4、内皮素-1、E选择素的mRNA表达水平下调，eNOS、Sirt1的mRNA表达水平上调（P0.01） 结论： 冬虫夏草粗提物可促进内皮细胞生长增殖，促进细胞进入细胞周期进程抑制凋亡；可促进内皮细胞NO分泌，下调E-选择素及内皮素-1mRNA表达，进而改善内皮功能。其可能是通过降低细胞内活性氧，减轻细胞氧化应激损伤及上调Sirt1-mRNA表达而发挥对内皮细胞的保护作用。