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《福建医科大学》 2013年
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抑制自噬对骨髓瘤细胞药物干预敏感性及DEPTOR在调节自噬和凋亡中作用的实验研究

张浩然  
【摘要】:DEPTOR是和mTOR相互作用的蛋白其起着抑制mTOR复合物1(mTORC1)、活化mTOR复合物2(mTORC2)的作用。研究显示在大多数肿瘤上DEPTOR的表达水平呈低表达,但同时发现在骨髓瘤细胞系如人骨髓瘤细胞株RPMI-8226中为高表达,并且DEPTOR具有调节磷脂酰肌醇3-激酶PI3K/蛋白激酶B(Akt)信号通路的作用。而PI3K/Akt的活性状态对骨髓瘤细胞的生存是重要的,并且PI3K/Akt信号通路和细胞增殖、分化及凋亡有关,此通路的下游包括caspase-3和caspase-9等。 另一方面有研究报道mTORC1和PI3K/Akt有阻断自噬的作用。并且自噬和凋亡的关系在近十多年里被广泛研究和关注。另外有些研究显示阻断自噬可诱导凋亡。因此本研究试图明确DEPTOR在自噬方面存在的作用。并且我们推测干扰DEPTOR基因也许对多发性骨髓瘤的治疗具有重要的意义。本研究旨在探讨DEPTOR在增殖、凋亡和自噬中的作用并试阐明DEPTOR在增强骨髓瘤化疗敏感性方面的机制。 第一部分抑制细胞的自噬对化疗药物的抗骨髓瘤活性的影响 研究目的:研究自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对多柔比星(doxorubicin,DOX)处理的骨髓瘤细胞RPMI-8226存活率的影响,并探讨其机制。研究方法:以四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测3-MA抑制自噬前后,DOX对RPMI-8226细胞增殖抑制作用的变化;Western blot检测凋亡活化蛋白表达的变化,并用Western blot分别检测自噬相关蛋白LC-3及Atg5的变化,同时透射电镜用于观察自噬体的变化。研究结果:DOX可诱导骨髓瘤细胞RPMI-8226产生自噬,自噬相关蛋白水平表达增加;3-MA与DOX联合作用可明显增强RPMI-8226细胞的凋亡,3-MA抑制DOX诱导的自噬。结论:DOX诱导骨髓瘤细胞RPMI-8226凋亡的过程中自噬起到保护性作用;抑制自噬可明显增强DOX诱导的RPMI-8226细胞凋亡。3-MA可能为提高骨髓瘤对化疗敏感性提供新思路。 第二部分靶向人多发性骨髓瘤DEPTOR基因的shRNA慢病毒载体的构建及鉴定 研究目的:本研究探讨应用RNA干扰技术构建人DEPTOR基因的shRNA慢病毒载体,并鉴定在多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞上的沉默效果。研究方法:设计4个DEPTOR siRNA序列,化学合成后退火形成双链,克隆到酶切的hU6-MCS-CMV-EGFP(GV115)-shRNA慢病毒载体。重组质粒经PCR测序鉴定后,脂质体介导下转染293T细胞,Western blot检测DEPTOR的表达,筛选出干扰效果最佳的GV115-shRNA。将筛选的GV115-shRNA与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生成病毒,收集病毒上清并浓缩,测定浓度。将病毒颗粒感染多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞,应用Real-time PCR方法从mRNA水平及Western blot方法从蛋白水平检测DEPTOR的沉默效果。研究结果:构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,成功筛选出最有效抑制DEPTOR表达的shRNA2序列,包装病毒后滴度达到1×109TU/ml。慢病毒感染RPMI-8226细胞后可表达EGFP,Real-timePCR和Western blot检测DEPTOR的表达明显下降。结论:成功构建了DEPTORshRNA重组慢病毒载体,其转染多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞后显著抑制了DEPTOR的表达,为探讨DEPTOR在肿瘤基因治疗中的作用奠定了基础。 第三部分沉默DEPTOR基因对人多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖、凋亡和自噬的影响 研究目的:评价DEPTOR对人多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响及可能机制。研究方法:通过DEPTOR shRNA转染人多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞,以沉默DEPTOR基因。运用MTT法检测骨髓瘤细胞增殖能力的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡;用Western blot分析Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的变化。用透射电镜和单丹磺酰戊二胺(MDC)观察自噬体的变化。研究结果:下调DEPTOR基因可显著减慢骨髓瘤细胞的生长速度(P 0.05),肿瘤细胞的凋亡率上升(P 0.05)。DEPTOR shRNA上调Cleaved caspase-3、Cleaved PARP和Bax表达,下调Bcl-2及PI3K Akt信号通路的表达(P 0.05)。另外,在RPMI-8226细胞中下调DEPTOR基因可抑制自噬。结论: DEPTOR shRNA可以有效地抑制骨髓瘤细胞的增殖,诱导细胞的凋亡及抑制细胞自噬。PI3K Akt信号通路可能参与了其凋亡及自噬过程。 第四部分DEPTOR shRNA与抗瘤药物联合对多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖和凋亡的影响 研究目的:探讨DEPTOR shRNA与抗瘤药物联合对多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖和凋亡的影响及相关机制。研究方法:通过DEPTOR shRNA转染人多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞,以沉默DEPTOR基因。转染的细胞用化疗药物处理。运用MTT法检测骨髓瘤细胞增殖能力的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡;用Westernblot分析凋亡有关蛋白、自噬相关蛋白及PI3K/Akt信号通路蛋白的变化。用透射电镜和MDC观察自噬体的变化。研究结果:下调DEPTOR基因可增强化疗药物诱导的细胞阻滞和凋亡(P 0.05),增加凋亡相关蛋白(Cleaved caspase-3、Cleaved PARP)的表达和抑制自噬相关蛋白表达(P 0.05)。另外,在RPMI-8226细胞中下调DEPTOR基因抑制PI3K Akt信号通路的表达(P 0.05)。结论: DEPTORshRNA通过阻断PI3K/Akt活性可增强抗瘤药物对骨髓瘤细胞增殖的抑制,增加骨髓瘤细胞的凋亡。
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R733.3

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