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《福建医科大学》 2017年
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工具酶辅助信号放大的DNA电化学传感器

陈锦元  
【摘要】:基因检测在疾病早期诊断、预后评估及药物治疗指导等方面具有重要意义,因而在临床医学方面具有举足轻重的地位。为了提高临床医疗效率和降低医疗成本,使医学服务于广大人民群众,未来的基因检测将朝着床边诊断系统发展。DNA电化学传感器具有易于微型化、快速、高通量、高灵敏度、高特异性和价格低廉等优点,因而具有广阔的临床应用前景。为了实现实际样品中核酸的痕量分析,通过信号放大途径提高灵敏度尤为重要。基于分子生物学中工具酶的高催化能力、高生物相容性、高特异性和高灵活性等特征,本论文利用工具酶通过引入多个信号分子或使目标链放大等方式构建简单、超灵敏的DNA电化学传感器,实现了对复杂实际样品的检测,为DNA电化学传感器广泛应用于临床奠定扎实的基础,本论文主要研究工作如下:(1)在第一部分中,利用末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxyribonucleotide transferase,TdT)在恒温条件下无需模板即可催化多个脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)聚合到DNA分子的3’羟基末端的特点,构建了植入模式(grafting-to mode)的DNA电化学传感器。与传统的TdT介导的基于界面起始聚合(surface-initiated enzymatic polymerization,SIEP)模式的电化学传感器不同,本实验采用先均相延伸后固相杂交的方法引入多个信号分子。实验结果表明,SIEP模式所存在的高背景问题是由于TdT在界面作用时所产生,而并非是由探针的非特异性吸附所引起。然而,植入模式可以避免高背景的产生,使用较高的酶量即可快速的完成反应,所需反应时间从120 min降至20 min。通过对检测性能多方面的比较,植入模式在背景、时间、电流值等方面均显著优于SIEP模式。(2)在第二部分中,基于连接酶链式反应(ligation chain reaction,LCR)提出了一种简便、实用的双链组装型DNA电化学传感器。通过均相LCR扩增得到大量两端分别修饰有巯基和生物素的短双链DNA(dsDNA)片段,具有刚性结构的dsDNA通过金-硫键均匀的分布在牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)组装界面上,而末端生物素通过与链霉亲和素的特异性结合将HRP固定到金电极表面,最后通过辣根过氧化物酶(horeseradish peroxidase,HRP)催化TMB-H_2O_2底物进行电化学检测。结果表明,在目标DNA浓度为1.0×10~(-16)~1.0×10~-1111 M时,安培电流与和浓度对数值呈良好的线性关系,检测限为5.0×10~(-19)M(50μL的反应体系里含有15个目标DNA分子)。此外,该方法能够显著区分其他三种碱基所引起的单碱基错配,可用于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的分析。在实际样品应用中,该方法可直接从血清总核酸提取物(DNA/RNA)里的大量基因组和长短不一的RNA中检测出不同含量的C型乙型肝炎病毒(HBV)基因组,而对于B型样品和正常样品则没有响应,显示出很好的检测效果,且与基因测序和凝胶电泳结果相符。更为重要的是,通过改变引物序列可以检测不同的目标DNA序列,因此本方法具有通用性,有望用于临床各种疾病相关DNA标志物的定性定量分析。(3)本文第三部分在第二部分的基础上提出亲和素标记的多聚辣根过氧化物酶(SA-PolyHRP)与LCR双重信号放大用于急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)PML/RARα融合基因检测的电化学生物传感器,即将均匀分布在电极表面的经LCR扩增的每条短双链DNA末端结合多个HRP从而实现后放大(post-amplification)。选择酶联免疫分析中以不同方式引入多个HRP的链霉亲和素-酶标生物素复合物和链霉亲和素包被的HRP聚合物这两种酶复合物进行实验,结果表明链霉亲和素包被的HRP聚合物由于其外部的链霉亲和素层更易与电极表面的生物素结合而产生有效信号放大。针对固定局限在融合位点附近PML/RARα融合基因所设计的探针,本实验在引入SA-PolyHRP之后保证了灵敏度,可检测低至15个拷贝的目标DNA分子,在1.0×10~(-16) M到1.0×10~(-13) M浓度范围内,安培电流与浓度的对数值呈线性关系,与传统的SA-HRP相比,其在灵敏度上提高近2个数量级。此外,在引入SA-PolyHRP之后,本方法同样具有较高的特异性,能够显著区分其他三种碱基所引起的单碱基错配,而且本实验所设计的PML/RARα融合基因探针区分单碱基错配的能力更加显著。
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TP212.2;R440

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