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《福建医科大学》 2002年
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纤维连接蛋白及其相关多肽对败血症及弥漫性血管内凝血的实验研究

吴勇  
【摘要】: 感染与出血是急性白血病死亡的两大主要原因,在引起出血的诸多原因中,弥漫性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)的危害性最大。感染尤其是败血症休克可诱发DIC,而DIC形成后又进一步加重休克,最终导致多器官功能衰竭等严重并发症,病死率极高。大量的临床研究表明血浆纤维连接蛋白(fibronectin,FN)水平对于内毒素休克并发DIC的预后判断具有重要意义。败血症休克患者血浆FN水平明显而急剧降低,且DIC发生率高。给败血症患者补充富含FN的冷沉淀素,则在患者血浆FN恢复的同时,伴有心肺功能的改善及败血症的控制,DIC的发生率也下降。Barkagan等给106例败血症伴DIC患者输注富含FN的冷沉淀物,取得显著疗效。Brodin B等给28例严重感染住院患者补充冷沉淀物,观察血浆FN水平及DIC相关指标的变化,结果发现,患者血浆FN恢复正常,且无一例发生DIC,提示FN可用于败血症及DIC的替代治疗。有关FN对内毒素及DIC作用,目前尚不清楚。已知FN是一种大分子多功能糖蛋白,能跟肝素、胶原、纤维蛋白以及整和素家族的细胞表面受体结合,参与细胞粘附与迁移、止血过程、损伤修复等。FN分子的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)三肽序列结构是主要细胞结合位点,FN通过RGD三肽序列同细胞表面整合素受体相结合并将细胞外信息传入细胞内,引起细胞发生 一系列变化。除了RGD结构外,其周围序列对FN的功能产生重要的影响,如在 尺GO序列上游111型重复序列中就存在一段对细胞粘附具有协同作用的序列。此 外,尺GD结构周围的剪切加工位点如EI工IA区对细胞粘附同样具有协同作用。有 关应用纯化和重组FN或其相关功能多肤治疗败血症及D工C,国内外均未见报道。 本研究首先在建立鼠败血症及0[C模型的基础上,应用明胶亲和层析从血浆中纯 化阳,研究其抗败血症及叭C的作用。然后构建重组人FN细胞结合位点功能区 片段(I上el363一Tyr1725),包含RGD序列及其上游FN3中细胞粘附协同序列以及 EIHA区的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,通过纯化得到重组FN细胞结合功 能区多肤(rhFN55),并经功能分析,为其用于败血症及OIC的治疗提供实验依据。 本文的主要研究包括以下两方面: FN对鼠败血症及OIC模型的作用 (1)采用明胶亲和层析法从正常人血浆纯化刚,经SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳及 蛋白印迹法鉴定其纯度及特异性后,用EL工SA法测定其含量。 (2)应用病理组织学、电镜观察超微结构、片段化DNA分析、盯一PCR、EL工SA 法检测血浆FN对半乳糖胺增敏的内毒素血症小鼠的作用,初步探讨其作用机制。 (3)应用.血细胞计数仪及血红蛋白凝集测定仪、病理组织学及ELISA法检测血 浆刚对内毒素一诱导大鼠DIC作用,初步探讨其作用机制。 2.rhl:N55对鼠败血症及D[C模型的作用 (l)采用基因重组技术,构建表达rhFN55的原核表达载体,用505一聚丙烯酞 胺凝胶电泳及蛋白印迹法鉴定其表达。 (2)采用生物素亲和层析纯化rhFN55,经505一聚丙烯酞胺凝胶电泳鉴定其纯度 后,用Bradford法测定其含量。 (3)采用细胞粘附试验测定rhFN55及市售商品化FN多肤(G4393为FNS肤含 RGD细胞结合位点;F3667为FNS月太对RGD具有粘附促进作用;FO793为刚12 肤即FN 1 377一1388位于RGO上游对其具有粘附协同作用。)的细胞粘附能力,动 物实验检测rhFN55及商品化FN多肤对半乳糖胺增敏的内毒素血症小鼠及内毒素 诱导DIC大鼠的作用。 取得如下结果及结论 .采用明胶亲和层析法从正常人血浆纯化FN的纯度及特异性均高。 2.FN能降低半乳糖胺增敏的内毒素血症小鼠的死亡率,半乳糖胺敏化内毒素小 鼠的死亡率达80W0,刚治疗组小鼠的死亡率为20%。病理组织学观察发现半乳糖 胺敏化内毒素小鼠肝细胞出现广泛坏死,而FN治疗组肝细胞仅见轻微坏死:电镜 观察发现半乳糖胺敏化内毒素小鼠多数肝细胞呈凋亡性改变,刚治疗组肝细胞 大小形态结构大致正常,未见凋亡细胞:ONA片段化分析半乳糖胺敏化内毒素小 鼠肝细胞可见明显梯形降解DNA片段,FN治疗组则无:RT一PCR检测表明半乳糖 胺敏化内毒素小鼠肝组织TNF。、儿一l旦、工L一6m尺NA表达水平均高于正常小鼠, FN治疗组小鼠肝组织TNFa、工L一l日、IL一6 mRNA表达水平则接近正常小鼠;队汇SA 法检测发现半乳糖胺敏化内毒素小鼠血浆TNFQ表达水平显著增高,FN治疗组小 鼠血浆‘「N厂。表达水平明显低于未治疗组。 3.FN能纠下内毒素一诱导的大鼠O优,并降低大鼠血浆因内毒素所致TNFQ表达 水平增高。 4.成功构建rhFN55的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达。 5.采用生物素亲和层析纯化可获得高纯度rhFN55。细胞粘附实验表明。hFN55 的细胞粘附能力高于商品化FN多肤;动物实验表明rhFN55处理的半乳糖胺敏化 内毒素血症小鼠的存活率高于商品化FN多肤,病理组织学观察发现rhFN55处理 的半乳糖胺敏化内毒素小鼠肝细胞仅见轻微坏死现象,而商品化刚多肤处理组 小鼠肝细胞混浊肿胀,并出现明显坏死现象;rhFN55可以纠正L陀诱导的大鼠 DIC,减轻DIC大鼠肺组织、肝组织血栓形成,其效果优于商品化FN多肤。说明 FN分子中除RGD外,
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R554.8;R515.3

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