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成人生精小管cDNA表达文库构建及小管生精细胞的分离

李鑫   
【摘要】:目的:1.构建成人生精小管cDNA表达文库; 2.利用复合酶消化合并非连续Percoll梯度法从成人生精小管中分离纯化生精细胞。 方法:本研究以成人生精小管为研究对象:1.通过Trizol法,从成人生精小管中提取总RNA,经Oligo(dT)-纤维素法分离纯化mRNA,逆转录生成双链cDNA,克隆至表达质粒载体pSPORT ?,经高效电转化至DH5a大肠杆菌中,构建成人生精小管cDNA质粒表达文库,同时对二个表达序列标签(EST)进行分析。2.以复合酶消化结合非连续Percoll梯度离心,尝试从成人生精小管中快速分离纯化生精细胞。 结果:1. cDNA文库的容量大致为1.1×106 cfu,重组率约为93%,插入片段的平均长度约1.3kb,表明构建文库的质量较好;2.其中一条EST 同促性腺激素释放激素受体2(gonadotropin-releasing hormone receptor 2)在蛋白水平具有31%的同源性,而另外一条EST在蛋白水平与钙调蛋白存在26%的同源性,发现其含有一段编码128个氨基酸的开放阅读框并可能存在一个保守结构域(conserved domains,CD),与钙调蛋白及其相关蛋白家族的结构域(151个氨基酸构成)存在60.9%的相关性,上述ESTs GeneBank登录号为: CN445900, CN445899;3.通过合理的复合酶消化并设置22%-30%-35%-40%四层非连续Percoll梯度分离发现:22%梯度处主要为精子细胞,纯度为91.7%;30%梯度处细胞密度最大(P0.05),富含各级未成熟的生精细胞,含量为88.6%。 结论:1.成功构建了成人生精小管cDNA质粒表达文库;2.发现一条可能代表人促性腺激素释放激素受体同源蛋白的EST,另一所编码的蛋白考虑为钙 WP=5 调素的同源蛋白;3.将复合酶消化合并非连续Percoll梯度法应用于分离成人生精小管精子细胞和未成熟生精细胞。


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