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《福建医科大学》 2004年
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腺病毒介导人白介素10离体转基因对大鼠同种异体肺移植物的影响

康明强  
【摘要】:目的 1.采用改良的三袖套法吻合技术建立大鼠左肺原位移植模型,进一步增加动物模型的稳定性,提高手术成功率及术后存活率; 2.利用人白介素10(hIL10)的抗炎和免疫抑制特性,以大鼠同种异体左肺原位移植为动物模型,离体供肺经肺静脉灌注外源性hIL-10基因重组的腺病毒载体,探讨离体经肺静脉法转染目的基因的可行性,观察腺病毒介导hIL10离体转基因对移植肺IR损伤和急性免疫排斥反应的影响,并分析其可能的作用机制; 方法 1.通过对供肺获取、套管制作选用与套接技术等方面的改进,采用改良的三袖套法肉眼直视下完成供受体肺动脉、肺动脉和支气管的吻合。再灌注后4h,阻断右肺门,分别于阻断前及阻断后20分钟,经腹主动脉采血作血气分析,选择性测定移植肺功能;并分别于再植后4h、5d、14d三个时段通过影像学、病理组织学等手段,了解移植肺病理情况,评价该模型复制肺IR损伤和急性免疫排斥的能力; 2.以SD大鼠为供受体,改良的三袖套法建立大鼠左肺原位移植模型,左供肺获取后,基因转染组(D组)离体经肺静脉逆行灌注5×10~9 PFU hIL-10基因重组的腺病毒载体,10℃LPDG保存3hr后移入受鼠;空载体对照组(C组,n=7)灌注空白腺病毒载体;空白对照组(B组,n=7)灌注10℃ LPDG;并设假手术对照组(A组,n=7);移植肺再灌注后4小时,测定指标。测定PaO_2、干-湿重比率了解移植肺功能;检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物 歧化酶 色检测 (SOD)活性、髓过氧化物酶(MPO)活性;Rl’- PCR、免疫组化染 hIL一10 的表达情况: 转染基因产物; 酶联免疫吸附法 免疫组化染色检测r1NF一。、IFN一Y、FaS、Fasl (ELISA)测定r1NF一a、IFN一Y的表达水平; 同时了解病理形态组织学改变及细胞凋亡情况。 3.以wistar大鼠为供体、SD大鼠为受体,改良的三袖套法建立大鼠左肺原位 移植模型,左供肺获取后,基因转染组离体经肺静脉逆行灌注5x109 PFU hIL一10基因重组的腺病毒载体,10’CLPDG保存3hr后移入受鼠。移植后5d, 杀死受体鼠取样。Rl’- PCR、免疫组化染色检测hIL一10基因产物;免疫组化 染色检测工L2、TNF一Q、IFN一Y、FaS、Fasl的表达情况;酶联免疫吸附法 (EL工SA)测定ILZ、TNF一Q、IFN一Y的表达水平;同时测定排斥病理分级, 移植肺功能及细胞凋亡。 结果 1.连续进行大鼠左肺原位移植正式实验30例,单人操作、肉眼完成,手术成 功率90%,14d的存活率达89%,移植物缺血时间(23士5)min,总手术操作时 间(58士9)min。影像学、病理组织学检查证实,再灌注4h和术后5d分别成 功地复制出了典型的肺IR损伤和急性免疫排斥反应变化; 2.基因转染组再灌注后4小时,Rl’- PCR、免疫组化染色证实移植肺成功表达特 异性的hIL一10基因产物。与对照组比较,PaO:明显上升,W心比率降低, 差别有显著性意义(P0.01);MDA含量和MPO活性明显下降,SOD活性 明显升高(p0.01);TNF一a、IFN一Y、Fas及Fasl的表达量明显下降(p0.01); 基因转染组肺泡间质水肿明显减轻,炎细胞浸润减少,细胞凋亡减少; 3.基因转染组移植后5d,移植肺仍有效表达特异性的hIL一10基因产物。与对 照组比较,PaOZ明显上升印0.01),急性排斥级别降低印0.05);ILZ、诩F- 。、IFN一Y、Fas、FasL的表达量明显下降(p0.01); 4.TUNEL检测发现,非基因转染组再灌注后4小时和移植后5d移植肺出现明显 的细胞凋亡,FaS/FaSL表达明显增强,而与非基因转染组比较,基因转染组 移植肺的细胞凋亡指数明显下降(P0 .01), Fas/FasL表达明显减弱(P0.01); 结论 通过对传统的三袖套法吻合技术进行许多的改进,成功地建立大鼠左肺原位 移植模型,无需显微外科吻合技术,整个手术过程在单人操作、肉眼直视下 完成,手术成功率高,模型稳定,可复制性高,经济实用,是适合肺保存、 肺移植缺血再灌注损伤、肺移植免疫排斥等系列研究的理想动物模型; 离体供肺经肺静脉灌注法转染外源性目的基因是有效可行的; 腺病毒载体介导h工L10转基因能有效地抑制移植肺IR损伤,改善了早期移 植肺功能; 腺病毒载体介导h工L10转基因有效地抑制了同种异体肺移植的急性免疫排斥 反应,诱导局部的免疫抑制状态,改善了移植肺气体交换功能: FaS系统介导的凋亡在肺IR损伤和同种异体肺移植的急性免疫排斥反应过程 中起着一定的作用,可能参与hlL10转基因治疗移植肺IR和急性排斥的机 制。
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R655

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