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人眼小梁细胞体外培养及TNF-α对其表达MMPs的影响

濮清岚  
【摘要】: 目的:探讨体外培养人眼小梁细胞(human trabecular cells, HTCs)的方法,观察其生物学特性。并在此基础上研究肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对体外培养的HTCs基质金属蛋白酶(MMP-3、MMP-9)表达的影响、意义及核因子-κB(Nuclear factor-Kappa B, NF-κB)的特异抑制剂——二硫氨基甲酸吡啶(Pyrollidine dithocarba-mate, PDTC)对其表达的影响。 方法: (1)采用组织块培养法进行体外HTCs的培养,运用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐([3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide],MTT)比色法、倒置显微镜、透射电镜、免疫细胞化学法等方法观察体外培养的HTCs的生物学特性并进行鉴定。(2)采用RT-PCR法和酶谱分析法(zymography)检测体外培养的HTCs经0.0ng/ml(对照组)、1ng/ml、10ng/ml、25ng/mlTNF-α处理24h后,细胞表达MMP-3、MMP-9的量;运用NF-κB的特异抑制剂二硫氨基甲酸吡啶(Pyrollidine dithocarba-mate, PDTC)抑制NF-κB的活化,观察不同浓度TNF-α对体外培养的HTCsMMP-3,-9表达的影响。 结果:(1)组织块培养10-15天后可见细胞从其边缘向外生长,倒置显微镜下成梭形、圆形、椭圆形、并有多个突起,电镜可见HTCs表面有较多的微绒毛,细胞间缝隙连接,胞质内见很多次级溶酶体。(2)免疫细胞化学法检测纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)、层粘连蛋白(laminin,LN)和神经元烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)染色阳性,传三代细胞均表现为胞浆呈红色。(3)利用RT-PCR法检测1ng/ml、10ng/ml、25ng/ml的TNF-α实验组细胞MMP-3/β-actin吸光度比值分别为0.88±0.02,1.02±0.01,1.20±0.02 ,各实验组与对照组0.65±0.01相比, P0.05均有显著性差异,另10ng/ml、25ng/ml的TNF-α实验组细胞提前30min加入PDTC(100μM),MMP-3/β-actin吸光度比值分别为0.78±0.07,0.87±0.03,分别较未加入PDTC组有显著性差异(P0.05);1ng/ml、10ng/ml、25ng/ml的TNF-α实验组细胞MMP-9/β-actin吸光度比值分别为0.94±0.01,0.97±0.05,1.13±0.02,各实验组与对照组0.75±0.02相比,P0.05均有显著性差异,另10ng/ml、25ng/ml的TNF-α实验组细胞提前30min加入PDTC(100μM),MMP-9/β-actin吸光度比值分别为0.78±0.05,1.02±0.01,分别较未加入PDTC组有显著性差异(P0.05)。(4)酶谱分析法(zymography)检测1ng/ml、10ng/ml、25ng/ml的TNF-α实验组细胞MMP-3条带酶解量分别为114.55±5.62,216.10±11.21,276.86±


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