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《福建医科大学》 2009年
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腺病毒介导hBDNF基因修饰骨髓间质干细胞静脉移植治疗大鼠脊髓损伤

王长昇  
【摘要】: 第一部分重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP的构建与鉴定 目的构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标志人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因腺病毒载体。 方法以pDC316-hBDNF为模板,PCR扩增酶切获得hBDNF基因片段,并连接到带有EGFP标记基因的载体质粒pDC316-mCMV-EGFP上,构建穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP,利用AdMax包装系统,穿梭质粒与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,反复感染293细胞扩增病毒后,离子交换法纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度。 结果经PCR鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证实成功构建携带EGFP标志hBDNF基因的重组穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP。扩增纯化后,测得重组腺病毒颗粒数为2.4×1011VP / ml,OD260/ OD280值约为2.0,滴度为0.8×1010 CCID50/ ml。 结论已成功构建重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,为下一步感染大鼠骨髓间质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)及基因治疗脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)奠定实验基础。 第二部分hBDNF基因修饰的大鼠骨髓间质干细胞的获取及鉴定 目的将构建好的重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP转染大鼠骨髓间质干细胞,进一步检测hBDNF蛋白的表达从而获得有生物活性hBDNF修饰的rMSCs(hBDNF-rMSCs)。 方法提取SD大鼠新鲜骨髓,体外分离、培养rMSCs,流式细胞仪检测rMSCs表面标记物;重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP转染第三代大鼠骨髓间质干细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光信号,流式细胞仪检测转染率,RT-PCR法检测腺病毒转染rMSCs后hBDNFmRNA的表达,Western blotting法测定hBDNF的表达水平。 结果成功提取、分离、培养、扩增rMSCs,流式细胞仪检测CD34、CD45表达阴性,CD29、CD90表达阳性。重组腺病毒转染rMSCs后荧光激发可见绿色荧光信号,随腺病毒载体感染复数(multiple of infection,MOI)增加,rMSCs荧光表达增强,当感染复数MOI=100时,荧光显微镜下所有细胞可见荧光信号,流式细胞仪检测结果示rMSCs转染率随MOI的增加而增加,当MOI=100时其转染率为100%;hBDNF-rMSCs的hBDNFmRNA及hBDNF的表达水平均随腺病毒载体感染复数的增加而增加,当感染复数MOI=100时,表达水平达到高峰,3~10天为表达高峰期。 结论Ad5-hBDNF-EGFP成功转染rMSCs,获取hBDNF-rMSCs基因工程干细胞,该细胞可大量表达hBDNFmRNA及hBDNF蛋白,为下一步hBDNF-rMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤奠定了基础。关键词BDNF骨髓间质干细胞基因修饰 目的hBDNF-rMSCs基因工程干细胞经静脉注射移植入脊髓损伤大鼠,观察其在脊髓内存活、基因表达情况,及对大鼠脊髓损伤后神经结构修复和神经功能恢复的影响。 方法采用改良Allen法制备大鼠胸10脊髓损伤模型,随机分为假手术组、损伤对照组、空载体-rMSCs移植组及hBDNF-rMSCs移植组。模型建立3天后,对照组经尾静脉注射0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)1ml, hBDNF-rMSCs组、空载体-rMSCs组分别经尾静脉注射hBDNF-rMSCs及空载体-rMSCs单细胞悬液1ml。各组大鼠于损伤后24h、静脉注射后1、3、5W应用BBB评分、皮层体感诱发电位评价治疗前后的神经功能状况,通过荧光显微镜观测rMSCs在体内存活、分布情况,应用Western-blotting法测定损伤脊髓节段中hBDNF的表达,免疫组化技术检测损伤脊髓节段内胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经丝-200KD(NF-200)、突触素Ⅰ的表达变化情况,光电镜观察组织形态学变化。 结果与对照组相比,空载体-rMSCs移植组及hBDNF-rMSCs移植组大鼠神经功能改善明显,hBDNF-rMSCs组改善最为显著,BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)评分及皮层体感诱发电位(CSEP)检测结果均优于其它两组。空载体-rMSCs组及hBDNF-rMSCs组在荧光激发下均见到EGFP阳性细胞在损伤脊髓节段存活,有绿色荧光表达。Western-blotting法检测显示hBDNF-rMSCs组大量表达hBDNF,其余各组均无hBDNF的表达。细胞移植后各组均有GFAP、NF-200及突触素Ⅰ免疫反应阳性的细胞和纤维,hBDNF-rMSCs组表达水平最高。组织形态学观察,与对照组相比,空载体-rMSCs及hBDNF-rMSCs移植组损伤区域脊髓结构较完整、清晰。 结论hBDNF基因修饰的骨髓间质干细胞经静脉移植后可向脊髓损伤处聚集并存活,表达hBDNF蛋白,促进神经结构的修复及神经功能的恢复。
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R651.2

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