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2447nt-489nt乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白与肝细胞蛋白相互作用研究

陈金烟  
【摘要】: HBV基因组剪接变异体(spliced variants of hepatitis B virus genomes)是由HBV前基因组RNA (pregenomic RNA, pgRNA)经剪接并逆转录产生的亚基因组DNA。长度为2.2 kb的HBV剪接变异体又称为2447nt-489nt HBV剪接变异体占80%以上,可编码剪接特异性蛋白(Hepatitis B spliced protein, HBSP),并与病毒的持续性感染及致病性相关。本实验室先前利用酵母双杂交系统筛查肝细胞中与HBSP蛋白相互作用的细胞蛋白,分别获得纤维蛋白原γ链(fibrinogen gamma polypeptide, FGG)和微粒体环氧化物水解酶(microsomal epoxide hydrolase,mEH,编码基因为EPHX1)等几种候选蛋白。本研究在酵母双杂交系统初步筛查的基础上,进一步验证HBSP蛋白分别与FGG和mEH的相互作用,并探讨HBSP蛋白对患者凝血功能与肝脏生物转化功能的影响,从而探索其致病性。 本研究第一部分旨在证实HBSP与FGG及mEH蛋白间的相互作用。为此,构建了pGEX-HBSP载体(用于GST-pull down)、pDsRed-HBSP载体(用于激光共聚焦)、pBIND-HBSP、pBIND-HBSP1-47和pBIND-HBSP64-111载体(用于哺乳动物细胞双杂交和免疫共沉淀);同时,采用RT-PCR技术从Huh7细胞扩增得到FGG和EPHX1全长基因并构建pCMVTNT-FGG和pCMVTNT-EPHX1载体(用于体外转录翻译)、pAcGFP-FGG和pAcGFP-EPHX1载体(用于激光共聚焦)。体外和体内的实验结果显示,HBSP蛋白可以和FGG或mEH直接相互作用,而且该相互作用由HBSP蛋白的N端47个氨基酸介导。 本研究的第二部分旨在高效表达并获得高纯度HBSP融合蛋白,为此,将HBSP全长基因片段及其N端区域(编码N端47个氨基酸)和C端区域(编码N端64个氨基酸)分别克隆入原核表达载体pET43.1a(+)中,并在目的基因的C端引入可编码StrepII标签蛋白的基因片段,构建了pET-43-HBSP-StrepII、pET-43-HBSP1-47-StrepII、pET-43-HBSP48-111-StrepII和对照质粒pET-43-StrepII。之后应用IPTG诱导融合蛋白Nus-HBSP-StrepII、Nus-HBSP1-47-StrepII、Nus-HBSP48-111-StrepII和Nus-StrepII在Rosetta (DE3)中的表达。实验结果表明目的基因获得高效、可溶性表达,并通过Strep-Tactin系统亲和层析方法纯化得到高纯度的融合蛋白。 本研究的第三部分探讨HBSP蛋白对FGG/mEH相关功能的影响。应用纯化后的融合蛋白进行纤维蛋白原凝集实验、血小板粘附实验和血小板聚集实验;结果表明HBSP蛋白可以通过与FGG结合抑制纤维蛋白原的凝集、干扰血小板对纤维蛋白原的粘附、激活和ADP引起的血小板聚集,从而抑制凝血功能,且HBSP蛋白的完整性对其功能至关重要;同时应用高效液相方法体外验证了完整的HBSP蛋白与mEH结合可大大增强mEH的酶活性,并促进苯并芘(Benzo(a)pyrene, BaP)的代谢,增加了最终致癌物Benzo(a)pyrene-7r, 8s-dihydrodiol-9s,10r-epoxide(±) (BPDE)的生成。结果提示HBSP蛋白可能抑制患者的凝血功能,与HBV感染者的出血倾向有关;HBSP蛋白可以促进多环芳香烃的代谢,加速了致癌物的致癌作用。


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