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《福建医科大学》 2010年
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NF-κB信号通路对大鼠变应性鼻炎鼻粘膜上皮细胞水通道蛋白5表达的影响及变应性鼻炎高分泌性机制的研究

王伟伟  
【摘要】: [目的] 1.原代大鼠鼻粘膜上皮细胞的纯化、培养及其鉴定。 2.探讨环腺苷酸-蛋白激酶A (cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase-A,cAMP-PKA)信号通路对大鼠鼻粘膜上皮细胞水通道蛋白5(aquaporin 5AQP5)调控机制。 3.SD大鼠变应性鼻炎(Allergic rhinitis, AR)动物模型的建立及其评价。 4.探讨核因子kappa B(Nuclear factor kappa B NF-κB)信号通路对AQP5表达的影响。 5.探讨变应性鼻炎高分泌性的可能机制。 6.探讨变应性鼻炎时NF-κB信号通路和cAMP-PKA信号通路之间的cross-talk。 [方法] 1.采用差速贴壁法和条件限定培养基,纯化和培养大鼠鼻粘膜上皮细胞。免疫细胞化学染色鉴定细胞类型并判断其纯度。 2.PKA抑制剂H89(3μM)和cAMP激活剂forskolin (1μM)干预鼻粘膜上皮细胞12h和24h。CCK-8法检测H89和forskolin对上皮细胞生长的影响;免疫细胞化学染色、实时荧光定量PCR (Real-time PCR)及蛋白免疫印迹(western-blotting)检测各组鼻粘膜上皮细胞AQP5和p-CREB(Ser133)的表达。 3.通过卵清蛋白(OVA)全身和局部致敏,建立大鼠变应性鼻炎模型,Wright's染色检测模型组鼻腔分泌物和鼻粘膜组织嗜酸性粒细胞的表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测外周血IgE水平;行为学积分对动物模型进行评价。 4. NF-κB抑制剂四氢化吡咯二硫代氨基甲酸酯(Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium, PDTC 100mg/kg/d和50mg/kg/d)干预AR大鼠,免疫组织化学、western-blotting和Real-time PCR检测各组鼻粘膜组织NF-κBp65、p-CREB(Ser133)、AQP5、IL-1β、TNF-α及IL-6表达。 5.H89和forskolin干预AR大鼠,免疫组织化学、Real-time PCR和western-blotting检测各组鼻粘膜组织,NF-κBp65. p-CREB(Ser133)、AQP5、IL-1β及TNF-α表达。 6. Western-blotting检测各组鼻粘膜组织粘蛋白5AC(MUC5AC)和粘蛋白5B(MUC5B)表达。 [结果] 1.采用差速贴壁法和条件限定培养基,可成功纯化和培养鼻粘膜上皮细胞。免疫细胞化学染色鉴定鼻粘膜上皮细胞纯度可达95%。 2.H89和forskolin干预对大鼠鼻粘膜上皮细胞生长无显著影响。H89(3μM)干预12h和24h后,p-CREB(Ser133)和AQP5阳性细胞数较对照组明显减少,p-CREB(Ser133)蛋白、AQP5蛋白及AQP5mRNA表达较对照组明显减少;Forskolin (1μM)干预12h和24h后,p-CREB(Ser133)和AQP5阳性细胞数较对照组明显增多,p-CREB(Ser133)蛋白和AQP5蛋白及AQP5mRNA表达较对照组明显增多。 3.通过卵清蛋白全身和局部致敏建立SD大鼠AR模型,HE染色显示模型组鼻粘膜组织纤毛脱落、倒伏,血管、腺体增多,Wright's染色显示模型组嗜酸性粒细胞浸润;外周血IgE水平增高;行为学积分较对照组明显增高。 4.与对照组相比,模型组鼻粘膜组织NF-κBp65平均光密度值和蛋白表达明显增多,IL-1β、TNF-α及IL-6mRNA表达明显增多,p-CREB(Serl33)平均光密度和蛋白表达减少,AQP5平均光密度值、蛋白表达和mRNA表达减少;PDTC (100mg/kg/d and 50mg/kg/d)干预1d、3d和5d后,NF-KBp65平均光密度值和蛋白表达较模型组减少,IL-1β、TNF-α及IL-1βmRNA表达较模型组减少,p-CREB(Ser133)平均光密度值和蛋白表达较模型组增多,AQP5平均光密度值、蛋白表达和mRNA表达较模型组增多。 5.H89 (5mg/kg/d)干预1d、3d和5d后,NF-κBp65平均光密度值和蛋白表达较模型组增多,IL-1β及TNF-αmRNA表达较模型组增多,p-CREB(Ser133)平均光密度和蛋白表达较模型组减少,AQP5平均光密度值、蛋白表达和mRNA表达较模型组减少;Forskolin (5mg/kg/d)干预1d、3d和5d后,NF-κBp65平均光密度值和蛋白表达较模型组减少,IL-1β及TNF-αmRNA表达较模型组减少,p-CREB(Ser133)平均光密度值和蛋白表达较模型组增多,AQP5平均光密度值、蛋白表达和mRNA表达较模型组增多。 6.模型组MUC5AC和MUC5B蛋白表达较对照组明显增多;PDTC(100mg/kg/d and 50mg/kg/d)干预1d,3d和5d后,MUC5AC蛋白和MUC5B蛋白较模型组减少,H89(5mg/kg/d)干预1d,3d和5d后,MUC5AC蛋白和MUC5B蛋白表达较模型组增多。Forskolin(5mg/kg/d)干预1d,3d和5d后,MUC5AC蛋白和MUC5B蛋白表达较模型组减少。 [结论] 1.采用差速贴壁纯化法和条件限定培养基,可获得高纯度的鼻粘膜上皮细胞。 2. cAMP-PKA信号通路通过CREB丝氨酸残基133位点磷酸化途径参与了鼻粘膜上皮细胞AQP5表达调控。 3.通过全身和鼻腔局部OVA致敏,可成功建立SD大鼠变应性鼻炎动物模型。 4. NF-κB信号通路可能通过抑制CREB(Ser133)磷酸化途径或者通过NF-κBp65与p-CREB (Ser133)竞争性结合CBP途径下调AQP5表达。 5. NF-κB信号通路上调MUC5AC蛋白和MUC5B蛋白表达,可能引起变应性鼻炎高分泌性;AQP5的表达减少导致鼻腔分泌物清除或重吸收功能障碍,加速变应性鼻炎高分泌性。 6. cAMP-PKA信号通路可抑制NF-κB信号通路。
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R765.21

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【引证文献】
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