收藏本站
《福建师范大学》 2015年
加入收藏

长角血蜱谷氨酰胺转胺酶的真核表达及分子特征分析

胡燕红  
【摘要】:长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是一种常见的体表吸血寄生虫,不但会对宿主造成损伤,还是巴贝斯虫、泰勒虫等病原虫的传播媒介。谷氨酰胺转胺酶(TGase)参与了节肢动物血淋巴的凝集和皮肤角质层的形成,在节肢动物的免疫过程中发挥着重要的作用。实验室前期从长角血蜱的EST文库中克隆了谷氨酰胺转胺酶的全长基因,并将HlTGase基因亚克隆到大肠杆菌中,诱导表达出了具有一定生物活性的重组蛋白rH1TGase,但该重组蛋白表达量和活性均较低,鉴于长角血蜱是真核生物,真核生物蛋白质翻译后的修饰往往与功能相关,本实验成功构建了真核表达质粒pPICZC/HlTGase,将HlTGase基因亚克隆入毕赤酵母(Pichiapastoris)中。用甲醇诱导含重组质粒的毕赤酵母表达外源基因,用抗rHlTGase鼠血清和抗多聚组氨酸抗体进行Western blotting分析,结果表明重组蛋白His-rH1TGase已在真核表达系统中成功表达。在不同的条件下进行诱导表达,结果显示pH为5.0,诱导温度为30℃时表达量较高,而His-rH1TGase最佳的表达量约为250 μg/mL。根据His-rH1TGase催化生物素标记的戊胺共价偶联到干酪素后产生的荧光强度与波长的变化测定His-rH1TGase活性,结果显示:His-rH1TGase能够催化干酪素和戊胺的交联,在25℃、催化时间长达3 h后,酶的催化活性达到最高值。用扫描电镜观察His-rH1TGase催化干酪素的交联效果,结果发现蛋白质的构象发生了明显变化,形成了更为致密的结构。通过对His-rH1TGase生物活性分析,了解其酶学特征,有助于我们进一步了解该酶在长角血蜱中发挥的生理功能,以便为长角血蜱的防治提供科学依据。而且来自长角血蜱的谷氨酰胺转胺酶是否可以用作食品添加剂改善食品的外观和风味并用于新型生物医学材料的研制,有待进一步的研究。
【关键词】:长角血蜱 谷氨酰胺转胺酶 克隆 表达 酶学分析
【学位授予单位】:福建师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R384.4
【目录】:
  • 中文摘要2-3
  • Abstract3-4
  • 中文文摘4-9
  • 绪论9-19
  • 1 长角血蜱的概述9-11
  • 1.1 长角血蜱的生活周期9-10
  • 1.2 长角血蜱的危害10
  • 1.3 长角血蜱的防治10-11
  • 2 谷氨酰胺转胺酶的研究进展11-17
  • 2.1 谷氨酰胺转胺酶的概述11-12
  • 2.2 谷氨酰胺转胺酶的作用原理12
  • 2.3 谷氨酰胺转胺酶的应用12-17
  • 3 本实验的研究内容及其意义17-19
  • 第一章 长角血蜱谷氨酰胺转胺酶在毕赤酵母中的表达19-39
  • 1.1 前言19
  • 1.2 材料19-20
  • 1.3 方法20-25
  • 1.3.1 HlTGase基因序列的分析20
  • 1.3.2 HlTGase基因亚克隆于酵母表达系统20-23
  • 1.3.3 重组酵母中外源基因的诱导表达和鉴定23-24
  • 1.3.4 重组酵母表达条件的优化24-25
  • 1.3.5 重组酵母的表达和纯化25
  • 1.4 结果与分析25-36
  • 1.4.1 HlTGase基因的生物信息学分析结果25-28
  • 1.4.2 HlTGase基因亚克隆于酵母表达系统28-31
  • 1.4.3 重组酵母中外源基因的诱导表达和鉴定31-33
  • 1.4.4 重组酵母表达条件的优化33-35
  • 1.4.5 His-rHlTGase的纯化35-36
  • 1.5 讨论36-39
  • 第二章 His-rHlTGase的酶动力学测定39-49
  • 2.1 前言39
  • 2.2 材料39
  • 2.3 方法39-42
  • 2.3.1 His-rHlTGase的透析39-40
  • 2.3.2 His-rHlTGase的酶动力学测定40
  • 2.3.3 His-rHlTGase的酶学特征40-42
  • 2.4 结果与分析42-47
  • 2.4.1 His-rHlTGase的酶动力学测定42-43
  • 2.4.2 影响His-rHlTGase生物活性的因子43-47
  • 2.5 讨论47-49
  • 第三章 His-rHlTGase催化蛋白分子交联的效果观察49-55
  • 3.1 前言49
  • 3.2 材料49
  • 3.3 方法49-50
  • 3.3.1 以酪蛋白为底物,用His-rHlTGase催化蛋白分子交联49-50
  • 3.3.2 以BSA为底物,用His-rHlTGase催化蛋白分子交联50
  • 3.3.3 扫描电镜观察蛋白分子的交联50
  • 3.4 结果50-53
  • 3.5 讨论53-55
  • 结论55-57
  • 附录1 pGEX-4T-1及pPICZ C的基因图谱57-59
  • 附录2 英文缩略词表59-61
  • 附录3 主要试剂配方61-65
  • 参考文献65-73
  • 致谢73-75
  • 个人简历75-78

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 程力;张东旭;堵国成;陈坚;;添加胰蛋白酶促进Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062产谷氨酰胺转胺酶[J];中国生物工程杂志;2010年07期
2 何冬兰;邵坤彦;叶程;黄俊;尚敏邦;;微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化[J];中南民族大学学报(自然科学版);2012年03期
3 燕国梁,堵国成,陈坚;谷氨酰胺转胺酶发酵条件的优化研究[J];工业微生物;2003年01期
4 王璋,王灼维,莫湘筠;微生物谷氨酰胺转胺酶生产菌株的育种研究[J];中国生物工程杂志;2003年06期
5 蔡慧农,李亚玲,杨秋明,陈发河;微生物谷氨酰胺转胺酶研究进展[J];微生物学杂志;2003年06期
6 张春红;李长彪;陈国娟;刘长江;;灰轮丝链轮丝菌合成谷氨酰胺转胺酶发酵条件的研究[J];食品研究与开发;2006年03期
7 黄亮;刘和;张东旭;崔莉;堵国成;陈坚;;超滤法浓缩谷氨酰胺转胺酶的影响因素研究[J];工业微生物;2006年03期
8 范西强;陈艳娟;宋敏;张颖颖;常忠义;高红亮;;剪切力对链霉菌谷氨酰胺转胺酶发酵的影响[J];华北农学报;2008年S2期
9 黄六容;何冬兰;;产谷氨酰胺转胺酶菌株的生理生化特征[J];中南民族大学学报(自然科学版);2008年04期
10 宋敏;曹娟;张颖颖;高红亮;范西强;鲁心安;;不同菌落形态的链霉菌对产谷氨酰胺转胺酶的影响[J];广西农业生物科学;2008年04期
中国重要会议论文全文数据库 前6条
1 张春红;刘长江;;谷氨酰胺转胺酶对大豆分离蛋白改性的研究[A];农业机械化与全面建设小康社会——中国农业机械学会成立40周年庆典暨2003年学术年会论文集[C];2003年
2 张程杰;堵国成;李寅;陈坚;;添加羟胺诱导Streptonyces hygroscopicus产谷氨酰胺转胺酶[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
3 张春红;刘长江;;谷氨酰胺转胺酶对大豆分离蛋白改性的研究[A];中国农业机械学会成立40周年庆典暨2003年学术年会论文集[C];2003年
4 黄六容;何冬兰;刘梅芳;;产谷氨酰胺转胺酶菌株的筛选及其产酶条件研究[A];中国生物工程学会第四次会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2005年
5 刘长江;张春红;;微生物合成谷氨酰胺转胺酶的研究[A];全面建设小康社会:中国科技工作者的历史责任——中国科协2003年学术年会论文集(下)[C];2003年
6 黄亮;刘和;张东旭;崔莉;堵国成;陈坚;;超滤法浓缩谷氨酰胺转胺酶的影响因素研究[A];中国生物工程学会第四次会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2005年
中国重要报纸全文数据库 前2条
1 记者 郑晋鸣 通讯员 侯杰;江南大学平均一天产生一项专利[N];光明日报;2005年
2 本报记者 邱德生;如何正确使用谷氨酰胺转胺酶[N];中国食品报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 张东旭;吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶的活化机制和生理功能[D];江南大学;2008年
2 刘松;Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转胺酶的异源表达研究[D];江南大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘颖;产谷氨酰胺转胺酶菌株的诱变育种和发酵研究[D];华东师范大学;2013年
2 裴正培;突变茂源链霉菌谷氨酰胺转胺酶的性质研究[D];华东师范大学;2014年
3 黄劲舸;谷氨酰胺转胺酶菌株的诱变育种及发酵小试条件的探究[D];华东师范大学;2016年
4 童理明;分子改造提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性[D];江南大学;2016年
5 代风娇;谷氨酰胺转胺酶基因的定点突变及其酶学性质研究[D];中南民族大学;2015年
6 胡燕红;长角血蜱谷氨酰胺转胺酶的真核表达及分子特征分析[D];福建师范大学;2015年
7 许晓娟;通过发酵策略及诱变选育来提高谷氨酰胺转胺酶酶活[D];江南大学;2009年
8 曹丹玥;微生物谷氨酰胺转胺酶发酵培养基的优化[D];华东师范大学;2006年
9 尹少谦;吸水链霉菌产谷氨酰胺转胺酶的分离纯化、性质及应用研究[D];江南大学;2005年
10 黄亮;吸水链霉菌发酵法生产谷氨酰胺转胺酶过程中蛋白酶的产生及控制研究[D];江南大学;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026