收藏本站
《福建师范大学》 2016年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

扩展青霉脂肪酶的静电网络影响酶的性质

张文煌  
【摘要】:为了探究扩展青霉脂肪酶(PEL)静电网络对其自身催化特性的影响,本文利用定点突变技术,对PEL特定位点的氨基酸残基进行变换,并测定分析了脂肪酶突变体的酶学性质,主要内容包括:一、选点选取扩展青霉脂肪酶基因的16个位点:Asp44、Asp70、Asp74、Asp76、Glu83、Glul13、Glu127、Glu207、Arg63、Arg97、Arg101、Arg182、Lys16、Lys202、Lys219和Lys226。这16个位点,其中8个位点编码的氨基酸带负电荷(Asp和Glu),另外8个位点带正电荷(Arg和Lys),是PEL静电网络的重要组成部分。此外,所选的这16个位点都比较靠近PEL的盖子结构(67-75)或者活性中心(132Ser-241His-188Asp)。二、构建重组质粒PET-47b(+)-PEL-X(突变型)并预筛为了探究上述16个位点对PEL自身催化特性的影响,我们利用定点突变技术,逆转了其带电性质:将带负电荷的位点突变成带正电荷的Lys,将带正电荷的位点突变成带负电荷的Asp。成功构建突变体后,我们在E.coli.BL21(DE3)表达了脂肪酶突变体,结果表明,7个脂肪酶突变体表现了不同程度的活力,它们是Asp44Lys、Asp76Lys、Glu83Lys、Arg97Asp、Argl0lAsp、Lys202Asp 和 Lys219Asp,其余 9个脂肪酶突变体在三丁酸甘油酯鉴定板上几乎没有活力。随后,我们再次利用定点突变技术,对这9个没有活力的位点进行同性置换,即Asp(?)Glu或者Arg(?)Lys,在三丁酸甘油酯鉴定板上又获得了 3个有活力的脂肪酶突变体,即Lys16Arg、Glu113Asp和Lys226Arg。至此,总共获得10个有活力的脂肪酶突变体。三、有活力的脂肪酶突变体的真核表达及酶学性质探究将预筛获得的10个有活力的脂肪酶突变体,利用同样的定点突变技术构建相应的重组质粒pPIC3.5K-PEL-X(突变型),电转至毕赤酵母GS115,筛选获得其中5个突变体的高拷贝菌株。然后通过发酵获得较纯的酶液,测定分析各个脂肪酶突变体的酶学性质,结果如下:(1)Asp44Lys脂肪酶突变体Asp44Lys的表达量为0.06 mg/mL,只有野生型的30%;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为96 U/mg,是野生型的2.67倍;最适作用温度为32℃;最适作用pH为8.0,与野生型一样;不同pH处理后,在pH7.0达到最稳定状态;偏好短链的底物分子;经乙腈、丙酮以及乙醇处理后,相对残余活力分别是0%,29%和58%(野生型的分别为1%,32%和26%)。与野生型相比,其对乙醇有较好的耐受性。(2)Glu83Lys脂肪酶突变体Glu83Lys的表达量为0.11 mg/mL,只有野生型的55%;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为2928 U/mg,是野生型的81.33倍;最适作用温度为32℃;45℃处理10 min后的相对残余活力39%,是野生型的13倍;最适作用pH为8.0;耐受pH5.0-11.0,不同pH处理后,相对残余活力均保持70%以上,在对照中处于最稳定状态;嗜好长链的底物,对4-硝基苯基月桂酸酯(C12)和4-硝基苯基棕榈酸酯(C16)都有较好的活力;经乙腈处理后基本失活;经丙酮和乙醇处理和后,相对残余活力分别是对照的5.42倍和3.94倍,对二者的耐受性极好。(3)Arg97Asp脂肪酶突变体Arg97Asp的表达量为0.09 mg/mL,只有野生型的45%;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为63 U/mg,是野生型的1.75倍;最适作用温度为32℃;最适作用pH为7.0;不同pH处理后,在pH7.0达到最稳定状态;偏好短链的底物分子;经乙腈、丙酮以及乙醇处理后,相对残余活力分别为0%,67%和33%,对丙酮的耐受性较好。(4)Arg101Asp脂肪酶突变体Arg101Asp的表达量为0.24 mg/mL是野生型的1.2倍。对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为27U/mg,只有野生型的75%;最适作用温度为36℃;最适作用pH为7.0;不同pH处理后,在pH7.0达到最稳定状态;偏好短链的底物分子;经乙腈、丙酮以及乙醇处理后,相对残余活力分别为40%,60%和20%,对丙酮的耐受性较好。(5)Lys226Arg脂肪酶突变体Lys226Arg的表达量为0.32 mg/mL是野生型的1.6倍;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为21 U/mg,只有野生型的58.33%;最适作用温度为32℃;最适作用pH为8.0,与野生型一样;可以耐受pH5.0-11.0,在对照中处于最稳定的状态;偏好短链的底物,对4-硝基苯基月桂酸酯(C12)也略有偏爱;经乙腈、丙酮以及乙醇处理后,相对残余活力分别为6%,21%和31%,对乙醇的耐受性较好。
【学位授予单位】:福建师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q55

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 欧阳平,许顶立,刘伊丽,侯玉清,黄洪莲,戴云,刘新垣;野生型p53基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究[J];第一军医大学学报;1998年03期
2 童坦君;;P53的抑癌原理及应用前景[J];生命的化学(中国生物化学会通讯);1993年01期
3 朱全胜,丘钜世,王娅兰,张萌;重组野生型p53基因转染人骨肉瘤细胞株体外实验模型的建立[J];郧阳医学院学报;1998年01期
4 林楠;;我们都是突变体[J];基础医学与临床;2009年10期
5 黄群策,孙梅元,邓启云;水稻生殖突变体的外观形态特征研究[J];植物学通报;2001年02期
6 金卫华;曹军卫;王友亮;熊贵光;姚保利;雷铭;;细菌视紫红质多重突变体结构变化及其中间态的寿命[J];高等学校化学学报;2007年12期
7 傅锐斌;吴平生;邱健;向定成;马骏;洪长江;何建新;;氧浓度和钙离子对野生型及突变型低氧诱导因子-1α基因真核表达的影响[J];南方医科大学学报;2009年07期
8 ;中国科学家从玉米中提取出抗艾蛋白酶突变体[J];广西科学;2011年01期
9 胡忠,梁汉兴,彭丽萍;一个黄绿色水稻突变体的光合作用特性[J];云南植物研究;1981年04期
10 周松茂,李代玺,徐光华;水稻辐射突变体遗传变异的初步研究[J];遗传;1985年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 曹宛虹;陈杭;李晓东;辛世文;郑树;;人源野生型p53基因在烟草中的表达[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年
2 易小平;陈芳远;卢升安;周开达;;空间环境诱发水稻突变体特异亲和性研究[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展(上册)[C];1999年
3 戴新宾;张荣铣;许长成;匡廷云;;水稻叶绿素b减少突变体的光抑制特性研究[A];全国植物光合作用、光生物学及其相关的分子生物学学术研讨会论文摘要汇编[C];2001年
4 金卫华;曹军卫;姚保利;雷铭;;细菌视紫红质多突变体的构建及其功能研究[A];第二届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文集[C];2006年
5 胡天岑;王奎锋;李连维;陈静;蒋华良;沈旭;;SARS冠状病毒3CL蛋白酶突变体的结构对其聚合-活性关系的提示[A];中国晶体学会第四届全国会员代表大会暨学术会议学术论文摘要集[C];2008年
6 李鹏丽;王宁宁;;微型番茄黄叶突变体的获得与鉴定[A];中国植物生理学会第十次会员代表大会暨全国学术年会论文摘要汇编[C];2009年
7 程备久;mail.hf.ah.cn);李展;mail.hf.ah.cn);朱苏文;mail.hf.ah.cn);李纯;mail.hf.ah.cn);李培金;mail.hf.ah.cn);谢传晓;mail.hf.ah.cn);;玉米对生突变体的遗传与分子标记研究[A];第八届全国激光生物学学术会议暨《激光生物学》创刊十周年庆祝会会议指南及论文摘要[C];2002年
8 许晓明;张荣铣;;水稻叶绿素缺乏突变体的吸收光能分配特性[A];中国植物生理学会全国学术年会暨成立40周年庆祝大会学术论文摘要汇编[C];2003年
9 林植芳;彭长连;徐信兰;林桂珠;张景六;;两个新的水稻缺叶绿素b突变体光合作用的热稳定性[A];中国植物生理学会第九次全国会议论文摘要汇编[C];2004年
10 魏玉波;梁乃亭;布哈丽且木;;水稻永绿突变体及应用价值[A];中国科协2005年学术年会论文集——核科技、核应用、核经济论坛[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘慧芹;番茄疮痂病菌fur基因功能分析及Fe在寄主与病菌互作中的作用[D];山西农业大学;2014年
2 赵鹏;耐辐射异常球菌丙氨酸代谢相关基因在氧化胁迫应答中的作用及其调控[D];西北农林科技大学;2015年
3 白敬;大肠杆菌硝基还原酶NfsB的分子改造及其催化特性[D];大连理工大学;2015年
4 金四华;鸡匍匐性状分子遗传机理的研究[D];中国农业大学;2016年
5 刘文文;miR827-NLA-NRT1.7通路调控拟南芥硝态氮由源到库的机制研究[D];中国农业科学院;2016年
6 杨震林;食管鳞癌中AJUBA突变的分子机制及临床意义[D];北京协和医学院;2016年
7 董庆;玉米淀粉合成调控基因的挖掘及功能分析[D];安徽农业大学;2015年
8 张萌;X射线衍射辅助核磁共振解析华根霉脂肪酶溶液中结构、动力学特征及构效关系[D];江南大学;2017年
9 李林华;人体5-吡咯啉羧酸还原酶突变体结构与功能研究[D];昆明医科大学;2017年
10 刘凯;水稻硼缺陷突变体的基因克隆及其功能分析[D];南京农业大学;2014年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张文煌;扩展青霉脂肪酶的静电网络影响酶的性质[D];福建师范大学;2016年
2 刘浩;圆弧青霉脂肪酶分子改造及酶学性质研究[D];天津科技大学;2017年
3 王在宇;脂肪酶的生物制备以及复合脂肪酶系的筛选[D];北京化工大学;2017年
4 张雷雨;基于复杂网络理论和分子动力学模拟的脂肪酶热稳定性的研究[D];江南大学;2017年
5 谢荣;谷氨酰胺转氨酶在脂肪酶稳定性改善中的应用[D];北京化工大学;2017年
6 董景佳;水稻OsSRT基因的克隆及功能分析[D];黑龙江大学;2015年
7 许静;中国水仙休眠调控相关基因NFT1和NEIN3的功能研究[D];华东师范大学;2013年
8 惠林冲;莲藕NnDREB2A克隆、表达分析和功能验证[D];扬州大学;2015年
9 黄义玲;人重组精氨酸酶活性的研究[D];吉林大学;2016年
10 游颖;Uncv无毛小鼠iRhom2突变体分子功能的初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026