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《南昌大学》 2014年
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基于OATPs/oatps介导的麦冬皂苷D肝脏转运的分子学机制研究

张文  
【摘要】:背景: 麦冬皂苷D (Ophiopogonin D, OPD)是参麦注射液的主要的活性成分之一,后者常与其他药物联用治疗心脑血管疾病。近年来基于OATPs介导的中西药相互作用屡见报道。课题前期研究发现,大鼠分别静脉给予参麦注射液或等同剂量的OPD后,前者血浆中OPD的浓度较高,其血/肝浓度比值可达后者给药的5-7倍。OPD与OATPs/Oatps抑制剂联用后,大鼠肝脏中OPD的浓度明显减少,但血浆中OPD浓度增大,提示OPD可能经oatps介导摄取进入肝脏。因此,有必要通过体外细胞模型及质粒构建模型进一步深入研究OPD在肝脏摄取转运的分子学机制。 目的: 通过构建大鼠原代肝细胞模型,从细胞学水平研究OPD在肝脏中的摄取转运机制,初步推测OPD在大鼠原代肝细胞中的摄取与oatps的内在关联性。然后,构建特异性高表达人OATP1B1的质粒并通过转染获得稳定高表达的HEK293T细胞模型,从分子学水平进一步深入探讨OPD的肝脏转运途径及其机制,探寻并揭示中药组分与化学药物之间基于OATPs介导的相互作用及配伍机理。 方法: 1、大鼠原代肝细胞中OPD的转运机制研究 ①摸索和建立大鼠肝细胞样本中OPD的检测方法和样品处理方法 ②建立大鼠原代肝细胞模型,在显微镜下观察细胞形态,采用台盼蓝测定肝细胞的细胞活率及产率。 ③考察孵育时间、细胞密度和药物浓度对OPD摄取转运的影响,确定最佳摄取条件,考察OPD的摄取动力学特征,求算Vmax、Km等动力学参数。 ④研究oatps非特异性抑制剂利福平、瑞舒伐他汀对大鼠原代肝细胞中OPD摄取的影响,初步推测OPD肝脏转运与oatps介导的相关性。 ⑤选用oatps特异性抑制剂甘草酸、地高辛、四溴酚酞磺酸钠及布洛芬,分别与OPD联用,通过分析肝细胞中OPD浓度的变化,进一步确认OPD在大鼠肝细胞中摄取转运的主要通路。 2、OATP1B1*1a-HEK293T细胞中OPD的转运机制研究 ①摸索和建立HEK293T细胞样本中OPD的检测方法和样品处理方法。 ②构建OATP1B1*1a-GFP质粒并感染HEK293T细胞,获得高表达稳定的细胞模型。 ③用丁酸钠作用于OATP1B1*1a-HEK293T细胞,诱导OATP1B1基因的高表达,并通过瑞舒伐他汀摄取实验,进一步验证诱导模型是否成功。 ④研究OATP1B1*1a-HEK293T细胞中OPD的转运及其动力学特征,比较加OATP1B1抑制剂瑞舒伐他汀、利福平、四溴酚酞磺酸钠以及甘草酸后OPD肝脏转运的变化,进一步深入阐明OPD在OATP1B1*1a-HEK293T中的转运机制。 结果: 1、大鼠原代肝细胞中OPD的转运机制研究 ①建立的大鼠肝细胞破碎液中OPD的LC-MS测定方法专属性较好,灵敏度高,符合样本分析测试的相关要求。 ②原位两步胶原酶灌流法获得大鼠原代肝细胞活力大于85%,得率约为0.8-1×108/肝,符合药物摄取实验的要求。 ③原代肝细胞摄取OPD在5-10min迅速增加,10min后达到饱和;大鼠原代肝细胞接种密度在0.25x106-2x106/ml范围内,OPD的摄取随着细胞密度的增加而增加;OPD浓度在1-32μΜ范围内,其转运量随药物浓度增加而增加,当浓度达到16μΜ时,转运量增长趋于平缓,摄取达到饱和。根据米氏方程V=Vmax×[S]/(Km+S)计算,摄取动力学参数Km值为8.10μΜ,Vmax为54.39nmol-1.min-1.mg-1protein,Vmax/Km值为6.72。 ④不同浓度的瑞舒伐他汀(5、10、20μM)对大鼠原代肝细胞中OPD的摄取表现出一定的抑制作用,与对照组相比,4μM OPD的摄取分别减少了8.6%、17.42%、32.53%;8μM OPD的摄取分别减少了9.36%、25.37%、40.18%;16μM OPD的摄取分别减少了9.27%、23.61%、32.21%。利福平(0.5、1、2、8μM))对OPD在大鼠原代肝细胞中的转运无明显抑制作用。与对照组相比,差异不具有统计学意义。 ⑤oatp1b2特异性抑制剂甘草酸(5、10、20、40μM)能显著抑制OPD在大鼠原代肝细胞中的摄取,且随着GL浓度的增加,抑制作用加强,肝细胞中OPD的摄取分别减少了33.53%、39.92%、51.54%、57.50%,且具有极显著性统计学差异(P<0.01),抑制参数IC50为25.39μM。地高辛(oatp1a4特异性抑制剂)、四溴酚酞磺酸钠及布洛芬(oatp1a1特异性抑制剂)对OPD肝脏摄取几乎无明显抑制作用。 2、OATP1B1*1a-HEK293T细胞中OPD的转运机制研究 ①建立的HEK293T细胞样本中OPD的LC-MS测定方法专属性较好,灵敏度高,符合样本分析测试的相关要求。 ②构建的OATP1B1*1a-GFP质粒感染HEK293T细胞,通过阴性病毒预实验得出慢病毒MOI值为80时,感染率可达80%以上。然后携带OATP1B1*1a目的基因的慢病毒去感染HEK293T细胞,随着时间和MOI值的增加,荧光增强,提示重组细胞模型构建成功。 ③OATP1B1*1a-HEK293T细胞经丁酸钠(1mM)诱导48h后,对经典OATP1B1底物瑞舒伐他汀的摄取相当于未诱导组的2.3倍,证明模型诱导成功,可较好的用于下一步的OPD摄取转运实验。 ④OATP1B1*1a-HEK293T细胞中OPD的摄取动力学参数Km与Vmax分别为5.50μΜ与29.07nmol.min-1.mg-1protein。OATP1B1*1a-HEK293T细胞中瑞舒伐他汀的摄取动力学参数Km与Vmax分别为24.42μΜ与15.02nmol.min-1.mg-1protein。通过比较Km值及Vmax可以得出,相对于瑞舒伐他汀,OPD与OATP1B1的亲和力更强,且单位时间内转运速率更快。 ⑤不同浓度的瑞舒伐他汀(2、10、50μM)对OATP1B1*1a-HEK293T细胞中OPD的摄取有一定的抑制作用,可使细胞中OPD的摄取分别减少8.78±6.20%,29.23±9.58%,63.94±8.04%,抑制参数IC50为36.74μM。四溴酚酞磺酸钠和利福平对OATP1B1*1a-HEK293T细胞中OPD的摄取也具有抑制作用。不同浓度的四溴酚酞磺酸钠(8、20、50μM)可使OPD的摄取分别减少3.93±8.63%,9.03±6.73%,32.42±9.43%。不同浓度的利福平(15、30、60μM)可使OPD摄取减少24.77±6.09%,34.37±5.19%,52.90±5.56%,其抑制参数IC50为55.29μM。不同浓度的甘草酸(30、60、120μΜ)对OATP1B1介导的OPD的转运也有较弱的抑制作用。使OATP1B1*1a-HEK293T细胞转运OPD分别减少了7.61±9.02%,18.03±2.53%,20.83±4.66%。 结论: ①本实验建立的大鼠肝细胞破碎液及HEK293T细胞样本中OPD的LC-MS测定方法专属性较好,灵敏度高,可用于相关样本中OPD浓度的检测。 ②本实验建立的原位两步胶原酶灌流法获得的大鼠原代肝细胞活力较高,可用于肝细胞药物摄取转运及其机制研究。 ③本实验构建的OATP1B1*1a-HEK293T细胞诱导模型,OATP1B1表达稳定且活性较高,可较好的用于人源性肝细胞的药物转运及其机制研究。 ④OPD在大鼠原代肝细胞中能被摄取,且在加入oatps非特异性抑制剂瑞舒伐他汀(oatp1b2、oatp1a1及oatp1a4竞争性抑制剂)后,OPD的摄取明显减少,提示大鼠原代肝细胞中OPD的摄取可能与oatps有关。进一步研究表明,oatp1b2特异性抑制剂甘草酸(5、10、20、40μΜ)竞争性抑制原代肝细胞中OPD的摄取,且随浓度的增加,抑制作用越强。而利福平(oatp1a4和oatp1a1抑制剂)、地高辛(oatp1a4特异性抑制剂)、四溴酚酞磺酸钠及布洛芬(oatp1a1抑制剂)对OPD的摄取几乎无明显抑制作用。因此可以推断,OPD在大鼠原代肝细胞中的摄取转运与oatp1b2介导相关。 ⑤OPD在OATP1B1*1a-HEK293T细胞中能被摄取,相对于瑞舒伐他汀,OPD与OATP1B1的亲和力更强,且单位时间内转运速率更快。OATP1B1竞争性抑制剂瑞舒伐他汀、四溴酚酞磺酸钠、利福平及甘草酸均对OATP1B1*1a-HEK293T细胞中OPD的摄取有不同程度的抑制作用,进一步提示OPD是OATP1B1的底物,OATP1B1转运可能是OPD进入肝脏的主要途径之一。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R285

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【参考文献】
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