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《南昌大学》 2013年
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人参炔三醇对CYP3A介导的咪达唑仑不同羟化代谢影响的机制研究

何芳  
【摘要】:背景: 前期通过固相萃取、色谱逐级分离、波谱分析及结构鉴定等多种技术手段,确定人参炔三醇(Panaxytriol, PXT)为对咪达唑仑不同羟化代谢通路产生差异影响的物质,即抑制其4-羟化代谢,而激活其1′-羟化代谢。本课题通过大鼠肝微粒、人肝微粒体及大鼠原代肝细胞代谢模型,探讨PXT对CYP3A介导的MDZ不同羟化代谢通路影响的机制。 目的: 通过肝微粒体体外代谢方法从酶多结合位点角度分析人参炔三醇对CYP3A酶动力学的影响;并通过测定大鼠原代肝细胞中CYP3A探针底物咪达唑仑不同羟化代谢情况,反应人参炔三醇对CYP3A酶活性的影响;最后RT-PCR实验测定CYP3A1/2mRNA的表达情况,综合分析人参炔三醇对CYP3A介导的MDZ不同羟化代谢通路的影响机制,为临床安全合理用药提供科学依据。 方法: 1、PXT对大鼠及人肝微粒体中CYP3A介导的MDZ羟化代谢影响。 ①建立咪达唑仑在大鼠及人肝微粒体中的孵育方法及样品处理方法。建立温孵体系中咪达唑仑4-羟化及1′-羟化代谢产物的HPLC检测方法。 ②分析不同浓度人参炔三醇(0、0.5、1.0、2.0μg/ml)对肝微粒体中咪达唑仑不同羟化代谢酶促反应动力学参数的影响(Km、Vmax、CLint)。 2、PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A介导的MDZ羟化代谢影响。 ①建立大鼠原代肝细胞的分离及纯化方法。通过台盼蓝排斥实验测定肝细胞的活性及产率,运用光学显微镜观察肝细胞的显微结构。通过MTT实验测定MDZ、PXT对肝细胞的毒性作用,建立肝细胞样品中4-OH-MDZ及1′-OH-MDZ的LC-MS检测方法。分别从培养时间、肝细胞接种密度、底物浓度三个方面考察MDZ在大鼠原代肝细胞中4-羟化及1′-羟化代谢的酶促动力学特征。 ②研究CYP3A诱导剂地塞米松(Dexamethasone, DEX)、抑制剂酮康唑(Ketoconazole, KTZ)、实验组人参炔三醇(PXT)与MDZ在大鼠原代肝细胞中分别培养45min、4h、6h后,对MDZ4-羟化及1′-羟化代谢的影响。 3、PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A1/2mRNA表达的影响。 PXT与大鼠原代肝细胞分别培养45min、6h后,RT-PCR电泳检测PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A1/2mRNA表达的影响。 结果: 1、PXT对大鼠及人肝微粒体中CYP3A介导的MDZ羟化代谢影响。 ①建立了高效灵敏的微粒体样品4-OH-MDZ及1′-OH-MDZ的HPLC检测方法,符合分析检测要求。 ②PXT抑制肝微粒体中MDZ的4-羟化代谢,激活其1′-羟化代谢。在RLM中,PXT浓度分别为0、0.5、1.0、2.0μg/ml时,4-OH-MDZ的酶动力学参数Vmax由0.72nmol/min.mg pro逐渐减小至0.51nmol/min.mg pro,Km由5.12μM逐渐增加至7.26μM。CLint=Vmax/Km,CLint由0.14逐渐减小至0.07ml/min.mg pro,4-OH-MDZ的酶动力学参数在HLM中也呈现相同的趋势。通过双位点模型求算RLM中1′-OH-MDZ酶动力学参数Vmax1由0.38增加至0.84nmol/min.mg pro,Km1由8.9降低至5.4μM,CLint(Vmax1/Km1)由0.04增加至0.16ml/min.mg pro,在HLM中PXT对MDZ的1′-羟化代谢表现出相同的激活效果。 2、PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A介导的MDZ羟化代谢影响。 ①建立了成熟稳定的大鼠原代肝细胞分离方法,肝细胞活力较高达85%,产率为(0.4-0.8)x10~8/肝。建立了快速有效的肝细胞样品中4-OH-MDZ及1′-OH-MDZ的LC-MS检测方法,并且MTT实验确定MDZ、PXT浓度分别在1.0-40.0μM,0.5-20μg/ml范围内对肝细胞毒性较小。培养时间为0-120min,肝细胞接种密度为(0.75-3.0)x10~6/ml,MDZ浓度为1-10μM范围内,4-OH-MDZ及1′-OH-MDZ代谢产物基本呈线性增加;MDZ浓度达到10μM时,4-羟化及1′-羟化代谢产物近似达到饱和,符合经典的酶动力学特征。 ②与肝微粒体实验结果一致,PXT(0、1.0、4.0、8.0μg/ml)与MDZ在大鼠原代肝细胞中共同培养45min后,对MDZ的不同羟化代谢产生差异作用,即抑制其4-OH代谢,激活其1′-羟化代谢。随着培养时间的延长,PXT对咪达唑仑4-羟化代谢的抑制作用增强,并且对1′-羟化代谢也表现出抑制作用,PXT(1.0、4.0、8.0μg/ml)与MDZ共同培养6h后,与空白组相比1′-OH-MDZ分别降低为82.3%、68.2%、59.0%。提示PXT可能对肝细胞中CYP3A酶代谢活性产生抑制作用。 3、PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A1/2mRNA表达的影响。 PXT(2.0、4.0、8.0μg/ml)与大鼠原代肝细胞培养45min后,不影响肝细胞中CYP3A1/2mRNA表达水平;培养6h后,PXT(2.0μg/ml)不影响CYP3A1/2mRNA的表达水平,PXT(4.0、8.0μg/ml)使CYP3A1mRNA的表达分别降低为87%、80%,使CYP3A2mRNA的表达分别降低为89%、85%。 结论: 本实验通过大鼠及人肝微粒体体外代谢研究方法,根据酶多结合位点从酶动力学角度分析PXT对CYP3A介导的MDZ羟化代谢的影响。通过大鼠原代肝细胞体外代谢模型及RT-PCR实验,证实PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A酶的抑制作用在酶代谢活性水平及CYP3A1/2mRNA的表达水平上显示良好的一致性。分别从酶动力学角度、CYP3A酶代谢活性的变化以及CYP3A1/2mRNA表达水平三个方面,综合阐明人参炔三醇对CYP3A介导的MDZ不同羟化代谢通路的影响机制,为指导临床安全合理用药提供科学依据。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R96

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