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《南昌大学》 2015年
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淡水贝类i型和噬菌体型溶菌酶基因克隆与表达

戴文娟  
【摘要】:本实验采用巢氏PCR方法和RACE PCR技术分别克隆得到褶纹冠蚌i型溶菌酶基因(CpLYZ3)的cDNA序列,三角帆蚌噬菌体型溶菌酶基因(HcPLYZ)的cDNA序列。克隆得到的CpLYZ3 cDNA长为968bp,其中5'非编码区(UTR)为395bp,开放阅读框(ORF)含有432bp,3'非编码区(UTR)为141bp,编码143个氨基酸残基,推导的蛋白分子量为15.6KD,等电点为6.09,通过分析发现重组蛋白含有由17个氨基酸组成的信号肽。从多序列同源性比对发现,该基因具有i型溶菌酶基因中的一些保守功能位点:Glu61和Asp72,并且与其它的i型溶菌酶基因序列同源性较高27-87%,初步断定该序列属于i型溶菌酶基因。通过对CpLYZ3基因在褶纹冠蚌不同组织中的表达情况分析发现:CpLYZ3的mRNA表达在血淋巴、肝胰腺、外套膜、肌肉和鳃组织中存在差异。CpLYZ3在肝胰腺中的表达量是最高的,其次是在外套膜和鳃中,而在肌肉中表达量最低。分别用嗜水气单胞菌和肽聚糖刺激后,在血淋巴、肝胰腺和鳃组织中表达量均升高,在肝胰腺中表达量变化最明显,分别是空白对照的32倍和14.2倍。说明该溶菌酶主要在褶纹冠蚌肝胰腺中起作用。将褶纹冠蚌CpLYZ3序列与表达载体PET-30a(带有组氨酸标签)连接,成功构建了 PET-30a-LYZ3原核表达质粒。将该质粒转化到大肠杆菌BL21菌株后,诱导得到大量融合蛋白。经分析确认所获得的重组蛋白在21KD左右,与预测蛋白大小一致。HcPLYZ基因序列全长为829bp,其中5'UTR(非编码区)长度为97 bp;开放阅读框(ORF)长度为468bp;3'UTR长度为264bp,编码154个氨基酸。经分析发现,该蛋白N端没有信号肽。推导的蛋白分子量为17.6KD,等电点为5.89。推导的HcPLYZ氨基酸序列中包含2个高度保守的噬菌体型溶菌酶活性位点(Glu20和Asp29)。将三角帆蚌血淋巴、肝胰腺、鳃和外套膜这四个组织上洗脱下来的微生物涂平板,然后挑取菌落进行PCR,发现这些微生物中也存在HcPLYZ基因,因此初步推测HcPLYZ是从三角帆蚌体内共生菌中克隆得到。通过对HcPLYZ基因在三角帆蚌不同组织中的表达分析发现,在血淋巴、肝胰腺、外套膜、肌肉和鳃组织中均有表达。用嗜水气单胞菌刺激后,在血淋巴、肝胰腺和鳃组织中表达量均升高,在鳃中表达量变化最明显。说明该溶菌酶在三角帆蚌免疫反应中起到重要的作用。将三角帆蚌HcPLYZ序列与表达载体PET-30a(带有组氨酸标签)连接,成功构建了 PET-30a-LYZ3原核表达质粒。将该质粒转化到大肠杆菌BL21菌株后,诱导并成功表达出重组蛋白。通过Ni2+螯和层析法获得了纯化的蛋白。另外,以溶壁微球菌为底物,检测到重组HcPLYZ的最适pH为5.5,最适温度为50℃。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S944.1

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