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《南昌大学》 2015年
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基于UGTs介导的熊果酸Ⅱ相代谢研究

高瑞  
【摘要】:背景:前期研究发现熊果酸(UA)在NADPH-人肝微粒体(HLMs)体系中代谢率低于30%,而在UDPGA-HLMs体系中的代谢约80%左右,提示尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGTs)介导的Ⅱ相代谢可能是其主要的代谢途径。本课题主要研究基于UGT介导的UAⅡ相代谢通路以及参与UA葡萄糖醛酸化代谢的主要酶亚型,为进一步研究UA在人体中的代谢特征及其机制提供实验基础和理论依据。目的:通过人肝微粒体、肠微粒体等反应体系,系统研究UGTs介导的熊果酸代谢通路及其代谢特征,在此基础上应用UGTs重组酶、特异性抑制剂及底物关联性分析等技术手段,进一步确证介导UA葡萄糖醛酸化代谢的主要代谢酶系,为进一步深入研究UA与临床药物间基于UGTs介导的相互作用机制提供理论基础,为临床安全合理用药提供科学依据。方法:1、研究人肝微粒体中UGTs介导的UA葡萄糖醛酸化代谢1确定UA在UDPGA-HLMs反应体系中的最佳HLMs浓度及最佳温孵时间,并建立UA在UDPGA-HLMs体系中的孵育方法及样品处理方法。2建立灵敏、稳定的液质联用分析方法,定性或定量地检测UA及其葡萄糖醛酸化代谢产物。3研究反应体系中UA的浓度与孵育时间的相关性、UA葡萄糖醛酸化产物与底物浓度的相关性。4研究β-D-葡萄糖醛酸苷酶对葡萄糖醛酸化UA的水解作用。5研究系列浓度的UA加入UDPGA-HLMs反应体系后其葡萄糖醛酸化反应情况,拟合酶动力学曲线,并计算肝微粒体反应体系中酶动力学参数Km、Vmax、Clint。2、研究人肠微粒体中UGTs介导的UA葡萄糖醛酸化代谢将系列浓度的UA加入UDPGA-HIMs反应体系中,测定其葡萄糖醛酸化反应情况,拟合酶动力学曲线,并计算肠微粒体反应体系中酶动力学参数Km、Vmax、Clint。3、研究人UGT重组酶反应体系中UA的葡萄糖醛酸化代谢1将4、8、16μM的UA分别加入至不同的UGT重组酶反应体系中,测定其葡萄糖醛酸化反应情况,筛选参与UA葡萄糖醛酸化反应的UGTs酶亚型。2将系列浓度的UA加入至参与UA葡萄糖醛酸化反应的UGTs重组酶体系中进行孵育,测定葡萄糖醛酸化反应情况,拟合酶动力学曲线,并计算酶动力学参数Km、Vmax、Clint。4、研究特异性抑制剂对UA葡萄糖醛酸化代谢的影响分别将4μM UA、4μM UA+UGT1A3特异性抑制剂鹅去氧胆酸(10、20、50μM)、4μM UA+UGT1A4特异性抑制剂海柯皂苷元(10、20、50μM)、4μM UA+鹅去氧胆酸(10、20、50μM)+海柯皂苷元(10、20、50μM)加入至人肝微粒体反应体系中,采用LC-MS法测定对照组及实验组中UA葡萄糖醛酸化反应情况,分别计算鹅去氧胆酸和海柯皂苷元对UA葡萄糖醛酸化代谢的抑制作用(IC50)。5、研究UA与相应UGT酶探针底物的葡萄糖醛酸化反应关联性将4μM UA、2μM替米沙坦(UGT1A3探针底物)、10μM三氟拉嗪(UGT1A4探针底物)三种化合物均分别加入至8个不同个体来源的人肝微粒体反应体系中进行孵育,分别测定UA、替米沙坦、三氟拉嗪葡萄糖醛酸化反应情况,计算其代谢速率,由UA的葡萄糖醛酸化代谢速率分别对替米沙坦的葡萄糖醛酸化代谢速率、三氟拉嗪的葡萄糖醛酸化代谢速率做直线回归分析,评价其相关性。结果:1、人肝微粒体中UGTs介导的UA葡萄糖醛酸化代谢研究结果1 UA在不同浓度(0.25、0.5、1.0、1.5mg/ml)的HLMs孵育体系孵育30 min后,显示0.5 mg/ml HLMs孵育体系中UA的代谢率在30%左右;UA在0.5 mg/ml HLMs孵育体系中分别孵育15、30、45、60、90min后终止反应,显示在30min时UA的代谢率在30%左右,最终确定UA孵育体系的HLMs最佳孵育浓度是0.5 mg/ml,最佳孵育时间是30 min。2 UA与含有UDPGA的HLMs孵育体系孵育后,LC-MS/MS法对其进行定性分析,发现质谱图中有准分子离子峰m/z631.4([M-H]-),与UA的准分子离子峰m/z455.3([M-H]-)相差176Da,且其碎片离子中含有葡萄糖醛酸基团的特征性碎片离子m/z174.9和112.9,最终确定该代谢产物为葡萄糖醛酸化UA。本实验室建立的人肝微粒体中UA及葡萄糖醛酸化产物的液质联用分析方法重现性好、精密度高,稳定性好。3通过做时间和浓度曲线可以看出,在120 min内随着孵育时间的延长,UA浓度逐渐减少,葡萄糖醛酸化代谢产物相应增加;随着UA浓度(1~32μM)的增加,葡萄糖醛酸化代谢产物也相应增加。4经β-D-葡萄糖醛酸苷酶水解的样品中,UA葡萄糖醛酸化产物消失,UA原药的增加与UA葡萄糖醛酸化产物的减少基本一致。5 1-64μM的UA在UDPGA-HLMs孵育体系孵育中进行葡萄糖醛酸化反应的酶动力学参数Km、Vmax、Clint分别为3.29±0.16μM、0.33±0.03 nmol/min/(mg protein)和0.10μl/min/(mg protein)。2、0.25-16μM的UA在UDPGA-HIMs孵育体系孵育中进行葡萄糖醛酸化反应的酶动力学参数Km、Vmax、Clint分别为5.38±0.45μM、0.39±0.04 nmol/min/(mg protein)和0.07μl/min/(mg protein)。3、人UGT重组酶反应体系中UA的葡萄糖醛酸化代谢研究结果1 4、8、16μM的UA分别加入至不同的UGT重组酶(UGT1A1、1A3、1A4、1A6、1A7、1A8、1A9、1A10、2B4、2B7、2B15、2B17)体系中孵育后,结果显示只有在UGT1A3和UGT1A4重组酶体系中发生了葡萄糖醛酸化代谢,形成了UA的葡萄糖醛酸化产物。2 1-64μM的UA在UGT1A3、UGT1A4重组酶体系中进行葡萄糖醛酸化反应的酶动力学参数Km、Vmax、Clint分别为2.58±0.12和4.66±0.60μM、0.72±0.01和1.00±0.06 nmol/min/(mg protein)、0.28和0.21μl/min/(mg protein)。4、UGT1A3酶特异性抑制剂鹅去氧胆酸、UGT1A4酶特异性抑制剂海柯皂苷元均对人肝微粒体中UA的葡萄糖醛酸化代谢产生抑制作用,其IC50分别是28.26±2.9μM、51.79±4.3μM。5、UA的葡萄糖醛酸化代谢与UGT1A3探针底物替米沙坦葡萄糖醛酸代谢具有较显著的相关性(r=0.8752,p0.01),与UGT1A4探针底物三氟拉嗪的葡萄糖醛酸代谢也具有较好的相关性(r=0.7659,p0.01)。结论:通过体外代谢研究发现,在UDPGA-HLMs和HIMs孵育体系中UA都发生了UGTs介导的葡萄糖醛酸化代谢,UGT1A3和UGT1A4酶为UA葡萄糖醛酸化反应的主要代谢酶。UGT1A3特异性抑制剂鹅去氧胆酸和UGT1A4的特异性抑制剂海柯皂苷元均对人肝微粒体中UA的葡萄糖醛酸化反应有明显抑制作用,UA的葡萄糖醛酸化代谢与UGT1A3的探针底物替米沙坦的葡萄糖醛酸化代谢有较显著地相关性,与UGT1A4的探针底物三氟拉嗪的葡萄糖醛酸化代谢也有较好的相关性。这些结果都证实UA在在体外发生由UGTs介导的葡萄糖醛酸化代谢,且主要由UGT1A3、UGT1A4介导。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R285

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 崔冬雪;;尿苷二磷酸葡醛酸转移酶的研究进展[J];中国药理学与毒理学杂志;2013年01期
2 赵晶晶;陈娟娟;刘涛;方建国;万进;赵建华;李伟;刘静;赵贤哲;陈素华;;Anti-viral Effects of Urosolic Acid on Guinea Pig Cytomegalovirus In Vitro[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2012年06期
3 刘智宇;江蔚新;吴斌;;皂苷类成分吸收分布和代谢及排泄研究进展[J];中国现代药物应用;2012年21期
4 王亚平;胡园;董瑞华;刘泽源;刘皈阳;;齐墩果酸和熊果酸的人肝微粒体代谢研究[J];军事医学;2012年05期
5 王丽岩;谭爱萍;赵姗;吕国军;马小军;;人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGT)亚型参与反式-白藜芦醇体外代谢的研究[J];中国中药杂志;2012年04期
6 王娟;单进军;狄留庆;汪受传;蔡宝昌;;五环三萜皂苷类活性成分口服吸收与代谢研究进展[J];中草药;2012年01期
7 谢瑞芳;周昕;;中药对细胞色素P450代谢影响的研究进展[J];中国临床药理学与治疗学;2009年06期
8 张虹;范婷婷;方昱;;细胞色素P450 3A4的研究进展[J];中国医院药学杂志;2009年04期
9 刘洪玲;;水飞蓟素的化学成分及药理作用研究进展[J];中国民族民间医药;2008年07期
10 卢新建;;中药对药物代谢酶的影响[J];齐鲁药事;2008年06期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 程晓华;熊果酸体外吸收及代谢机制的研究[D];南昌大学;2007年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郭秀彩;张紫萍;邓英光;赵博欣;;4种水飞蓟素单体对鹅膏毒蕈中毒大鼠肝损伤的保护作用[J];今日药学;2017年01期
2 汪美汐;王宇光;徐焕华;张照研;马增春;肖成荣;谭洪玲;汤响林;高月;;何首乌中大黄素对L02肝细胞CYP亚酶表达及细胞毒性的影响[J];中国药理学通报;2016年11期
3 郝传铮;魏利;赵旭;陆芳芳;胡平;;水飞蓟素保护肾小球内皮细胞氧化损伤的效应与SIRT1及腺苷酸活化蛋白激酶α的作用机制[J];中国老年学杂志;2016年18期
4 代良敏;熊永爱;范奎;伍振峰;杨明;;酸水解地榆总皂苷制备地榆皂苷元的工艺优选[J];中草药;2016年14期
5 侯健;孙娥;宋捷;杨蕾;张振海;宁青;贾晓斌;;肝脏药物代谢酶CYP450与中药肝毒性的关系[J];中国中药杂志;2016年15期
6 黎田儿;罗晶;李军茂;黄何松;何明珍;欧阳辉;冯育林;杨世林;;基于UHPLC-Q-TOF-MS技术的白头翁皂苷B7在大鼠体内外的代谢产物分析[J];中国药学杂志;2016年14期
7 周宇;夏新华;李朝;张驰;;水飞蓟宾处方前研究[J];中国中医药信息杂志;2016年05期
8 柴进;向国春;封欣婵;张樑君;程英;陈文生;;齐墩果酸对阻塞性胆汁淤积大鼠胆酸转运蛋白OSTα/β和BSEP的调控作用[J];局解手术学杂志;2016年01期
9 郭兴蕾;曲素欣;于春华;;基于CYP3A4代谢性相互作用的儿童用药安全分析[J];中国药业;2015年18期
10 胡悦;赖宏强;李孝栋;;大鼠取血方式对白花蛇舌草组分中药药动学的影响[J];时珍国医国药;2015年08期
中国硕士学位论文全文数据库 前9条
1 崔东琦;通脉方组分中药的配伍机理研究[D];黑龙江中医药大学;2015年
2 冯慧玲;基于NF-κB信号通路研究熊果酸对MDR1 mRNA和P-gp表达的影响及其机制[D];南昌大学医学院;2015年
3 高瑞;基于UGTs介导的熊果酸Ⅱ相代谢研究[D];南昌大学医学院;2015年
4 王佳;人参中齐墩果酸型人参皂苷Ro的制备及大鼠体内代谢研究[D];吉林农业大学;2015年
5 孙利珍;纳米级高分子囊泡作为口服胰岛素载体材料的研究[D];江西科技师范大学;2014年
6 叶金华;P-gp介导阿托伐他汀与阿昔莫司摄取转运的相互作用及其机制研究[D];南昌大学;2014年
7 孙丹丹;熊果酸自微乳给药系统的研究[D];山东中医药大学;2013年
8 杨婧芝;MDR1基因多态性对富马酸卢帕他定吸收影响的机制研究[D];南昌大学;2012年
9 田娟;解郁胶囊中熊果酸人体药动学研究[D];中南大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 恽菲;狄留庆;蔡宝昌;赵晓莉;毕肖林;王令充;陶金华;杜秋;;中药制剂口服吸收生物利用度改善方法探讨[J];世界科学技术(中医药现代化);2009年06期
2 刘颖;刘登科;刘默;王平保;;齐墩果酸的药理作用和结构修饰[J];中草药;2009年S1期
3 钱敏;石力夫;胡晋红;;藁本内酯在大鼠肝微粒体中代谢的酶动力学[J];药学学报;2009年04期
4 赵云生;万德光;陈新;李占林;田洪岭;;五环三萜皂苷生物合成与调控的研究进展[J];中草药;2009年02期
5 黎阳;张铁军;刘素香;陈常青;;人参化学成分和药理研究进展[J];中草药;2009年01期
6 杨蕊;苏乐群;黄欣;;齐墩果酸自微乳大鼠在体胃肠道吸收动力学研究[J];中药材;2008年11期
7 宋丽;徐璐扬;张宁;;大鼠肠内微生物对甘草酸代谢的影响[J];上海中医药杂志;2008年09期
8 苏美英;周茂金;;液-质联用法测定反式白藜芦醇在大鼠和比格犬体内的代谢产物[J];中国医院药学杂志;2008年12期
9 王启斌;狄伟;程晓莉;张蓬华;涂自良;;葛根素对细胞色素P_(450)酶活性的影响[J];医药导报;2008年05期
10 刘树军;黄静娟;车念聪;;活血化痰基础方对大鼠非酒精性脂肪肝模型CYP2E1活性的影响[J];中西医结合肝病杂志;2008年02期
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 贺瑛;应用Caco-2细胞模型研究一些手性药物和十芦丁硫酸酯吸收转运机理[D];浙江大学;2006年
2 章新晶;酸枣仁皂苷A生物吸收的细胞学机制[D];南昌大学;2006年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 景崙;;葡萄糖醛酸[J];山西医学杂志;1962年03期
2 陈亚坤,李新,曾苏;N~+-葡萄糖醛酸缀合反应的物种差异[J];中国现代应用药学;2004年03期
3 ;葡萄糖醛酸鈣的研究試制[J];中国药学杂志;1958年09期
4 方恒同,张鸿典;葡萄糖醛酸治疗急性黄疸型传染性肝炎疗效观察[J];浙医学报;1965年01期
5 孙祺薰;;葡萄糖醛酸~(99m)锝的肾脏扫描[J];国外医学参考资料.药学分册;1978年01期
6 陈金榜;;葡萄糖醛酸钠工艺改进[J];医药工业;1979年02期
7 陈辉;和娴娴;;葡萄糖醛酸及其内酯制备方法的研究进展[J];山东食品发酵;2011年01期
8 王步云;;葡萄糖醛酸治療12例傳染性肝炎之初步臨床療效颧察[J];吉林医科大学学报;1961年02期
9 陈道纯,陈锡谋,林谷珍;胆汁内源性β-葡萄糖醛酸酶的酸化沉淀浓缩[J];福建医学院学报;1994年04期
10 陈道纯,陈锡谋,林谷珍;胆汁内源性β-葡萄糖醛酸酶真实活力的观察[J];福建医学院学报;1995年02期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 董瑞华;梁宇光;朱亮亮;房中则;梁思成;葛广波;杨凌;刘泽源;;香芹酚在人肝和肠道葡萄糖醛酸化代谢中代谢酶的鉴定[A];合理用药及新药评价专题研讨会日程安排与论文摘要[C];2010年
2 马国;吴宝剑;郜嵩;羊臻;马勇;;人UGT1A1介导的四个黄酮类化合物葡萄糖醛酸结合的相互部位选择性抑制(英文)[A];第十一届全国青年药学工作者最新科研成果交流会论文集[C];2012年
3 翁芸芳;;MODULATION OF DRUG-METABOLIZING ENZYMES BY FLAVONOIDS[A];海峡两岸三地药理学学术报告会论文汇编[C];2001年
中国重要报纸全文数据库 前2条
1 裴利霞;对药物葡萄糖醛酸结合反应的认识——老酶新认识 Understanding Drug Glucuronidation——New Insights Into an Old Enzyme[N];中国医药报;2006年
2 宁夏回族自治区中卫市医院 张兴;药物干扰糖尿病检验结果[N];健康报;2007年
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1 王海钠;人UGT2B7和UGT1A9单核苷酸多态性对一些药物选择性葡萄糖醛酸化代谢的影响[D];浙江大学;2011年
2 朱丹;魟鱼软骨多糖的研究[D];辽宁中医学院;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前6条
1 高瑞;基于UGTs介导的熊果酸Ⅱ相代谢研究[D];南昌大学医学院;2015年
2 姜丽;蟾蜍甾烯类成分去乙酰基华蟾毒精的Ⅱ相葡萄糖醛酸化代谢研究[D];大连医科大学;2015年
3 范艳群;葡萄糖醛酸标准物质的研究[D];厦门大学;2014年
4 郑书香;肌醇氧化酶在大肠杆菌中的高效表达及其催化生产葡萄糖醛酸的特性研究[D];浙江大学;2013年
5 金学利;山姜素在人肝微粒体中葡萄糖醛酸化代谢的研究[D];大连医科大学;2012年
6 熊小焱;Mn~(2+)/H_2O_2体系催化氧化甲苷合成葡萄糖醛酸及其内酯[D];武汉工程大学;2010年
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